本发明公开了一种辅助全细胞转化合成L 天冬酰胺的方法,本发明利用Ⅲ类多聚磷酸激酶2构建了单酶转化AMP再生ATP的系统,并将其应用于L 天冬酰胺的生物合成。将来自Deinococcus ficus的Ⅲ类PPK2在Escherichia coli Rosetta(DE3)中表达,酶活力为13.19U·mL 1。以***(DE3)/pET21a DfiPPK2 Ⅲ和***全细胞为催化剂催化L Asp合成L Asn并优化反应条件。结果显示两种重组菌湿细胞在最优反应条件下,并通过两次补料终浓度为60mmol·L 1的六偏磷酸钠,L Asn的得率到达90.15%,比直接添加180mmol·L 1的六偏磷酸钠高80%。

本发明构建了表达III类多聚磷酸激酶2的重组基因工程菌，与产L-天冬酰胺合成酶的重组菌耦合反应再生ATP，只需在反应液中添加少量的ATP和底物，就能实现从L-天冬氨酸向L-天冬酰胺的生物转化，大大减少了生物合成的成本。

本发明的第一个目的是提供一种辅助全细胞转化合成L-天冬酰胺的方法，所述方法是采用表达III类多聚磷酸激酶2的重组菌与表达L-天冬酰胺合成酶的重组菌耦合反应，催化L-天冬氨酸转化为L-天冬酰胺。

进一步地，所述的表达III类多聚磷酸激酶2的重组菌为在大肠杆菌宿主中过表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的III类多聚磷酸激酶2。

进一步地，所述的大肠杆菌宿主为Escherichia coli Rosetta(DE3)。

进一步地，所述的表达III类多聚磷酸激酶2的重组菌是以pET21a为表达载体。

进一步地，所述的表达L-天冬酰胺合成酶的重组菌为重组菌***-LsaAS-A。构建方法参照《天冬酰胺合成酶的基因挖掘与酶学性质研究》中国科技论文在线。

进一步地，所述的耦合反应中，反应体系为0.1-0.5mol·L-1L-Asp、0.1-0.8mol·L-1NH4Cl、1-10mmol·L-1ATP、100-250mmol·L-1MgCl2、5-150mmol·L-1六偏磷酸钠、0.5-1.5％曲拉通X-100，0.05-0.15mol·L-1Tris-HCl。

进一步地，所述的六偏磷酸钠通过两次补料添加到反应体系中。

进一步地，所述的耦合反应的反应温度为35-45℃，转速为250-250rpm。

进一步地，所述的表达III类多聚磷酸激酶2的重组菌与表达L-天冬酰胺合成酶的重组菌的菌体比例为0.5-1.5:1。

进一步地，耦合反应中，所述的表达III类多聚磷酸激酶2的重组菌的浓度为OD600＝8～12。

在本发明中，通过Ⅲ类多聚磷酸激酶2利用多聚磷酸单酶催化AMP生成ADP，只需添加单酶及廉价易得的底物多聚磷酸盐及金属离子即可实现AMP到ATP的再生。天冬酰胺合成酶在合成天冬酰胺的同时ATP脱去两个磷酸基团生成了AMP，所以利用基于III类PPK2的ATP再生系统可以只添加少量的ATP就能合成大量产物。

L-天冬酰胺中文又称为2-氨基-3-氨基甲酰丙酸。为白色的斜方晶系晶体或结晶性粉末，略带甜味，熔点约234℃。溶于水，几乎不溶于乙醇和乙醚，水溶液呈酸性。遇碱会水解成天冬氨酸。加热其水溶液容易分解。天冬氨酸在食品、医疗、化工以及生物方面都有所应用

天冬酰胺的制备方法有直接提取法、化学合成法和生物合成法。直接提取法主要是以白羽扇豆为主，经过发芽、成浆、加热等处理流程后，在pH不大于6的条件下，经过硅藻土过滤、离心，获得第一步粗品。然后再经过浓缩、结晶获得最后的成品。直接提取法受原料质量的影响较大，工艺复杂不易控制且会造成严重的污染。化学合成法主要是通过氨水和L-天冬氨酸为原料进行酰胺化反应产生L-天冬酰胺，使L-天冬氨酸上的羟基由氨基替代。该方法副反应多，下游提取困难，污染严重。生物合成法主要是通过天冬酰胺合成酶催化谷氨酰胺的氨基转移，需要ATP参与。该方法生产过程和设备简单，生产效率高，但是由于转化过程中需要ATP的参与，但是ATP价格昂贵，成本过高，性质不稳定，且在合成过程中会积累副产物(AMP或者ADP)，不仅增加了产物分离提纯的难度同时还有可能会造成产物抑制。

前期尝试在只添加表达天冬酰胺合成酶A的全细胞合成的反应体系中添加葡萄糖，通过糖酵解途径再生ATP，合成L-天冬酰胺，但是没有成功。

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本发明构建了表达III类多聚磷酸激酶2的重组基因工程菌，与产L-天冬酰胺合成酶的重组菌耦合反应再生ATP，只需在反应液中添加少量的ATP和底物，就能实现从L-天冬氨酸向L-天冬酰胺的高效生物转化，大大减少了生物合成的成本。

本发明利用OD600均为10的两种重组菌湿细胞在最优反应条件下，通过两次补料终浓度为60mmol·L-1的六偏磷酸钠的情况下，L-Asn的得率到达90.15％，比直接添加180mmol·L-1的六偏磷酸钠高80％。

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