本发明公开了一种比活提高的溶菌酶突变体,属于生物工程技术领域。本发明公开了一种利用基因工程在人源溶菌酶C末端添加疏水短肽Val Ile Pro Leu Phe而得到的人源溶菌酶突变体,其比活提高了126%。本发明还公开了一种含突变人源溶菌酶基因的重组质粒,以及经过该重组质粒转化毕赤酵母后获得的高效表达人源溶菌酶突变体的重组毕赤酵母基因工程菌。本发明获得的人源溶菌酶突变体具有比活高,制备简单的特点,具有潜在的临床应用价值,在饲料、食品工业上也具有广泛的用途。

本发明利用毕赤酵母表达系统来作为生产人源溶菌酶的表达系统，具有生产成本低、操作简单、生长迅速、表达效率高、发酵与分泌性能良好等优点，本发明优化后的编码人源溶菌酶m5HLM(氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)的基因经毕赤酵母表达系统产生的人源溶菌酶比活为21043U/g，较野生型提高了约126％。

溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，能够水解细菌细胞壁中β-1，4糖苷键，破坏细胞壁肽聚糖的结构，从而保护宿主细胞免受细菌感染。人源溶菌酶属于c型溶菌酶，由130个氨基酸组成，相对分子量为14700。人源溶菌酶还具有抗病毒、增强免疫力和抗肿瘤的功效。溶菌酶作为一种天然蛋白质，能在胃肠内作为营养物质被消化和吸收，对人及动物无毒害作用，也不会在体内残留，是一种安全性很高的药品、饲料和食品添加剂。在畜牧业溶菌酶可用作饲料防腐剂和杀菌剂。在食品行业，溶菌酶可作为抗菌防腐剂添加到食品中，且对人体无任何毒副作用，也可利用其具有一定甜味的特点，作为低卡路里的食品甜味剂。

目前，市场上销售的溶菌酶主要是从鸡蛋清、动物脏器等中提取获得的，这种溶菌酶热稳定性差，活力只有人源溶菌酶活力的一半。但人源溶菌酶受限于原料来源、纯化精制成本等因素，制备量较少，无法满足各领域的需求。因此，提供一种低成本的高产溶菌酶的方法，具有广阔的应用前景。

该成果发明人：吴丹 郑璞 陈鹏程 张莉芝

江南大学是教育部直属、国家“211工程”重点建设高校和“双一流”建设高校。学校具有悠久的办学历史、厚重的文化积淀，源起1902年创建的三江师范学堂，历经国立中央大学、南京大学等发展时期；1958年南京工学院食品工业系整建制东迁无锡独立建校，成立无锡轻工业学院；1962年无锡纺织工学院并入无锡轻工业学院；1995年更名为无锡轻工大学；2001年无锡轻工大学、江南学院、无锡教育学院合并组建江南大学；2003年东华大学无锡校区并入江南大学。

本发明通过基因工程技术在人源溶菌酶的C末端添加疏水短肽Val-Leu-Phe、Val-Ile-Pro-Leu-Phe或Val-Ile-Pro-Leu-Phe，分别获得人源溶菌酶m3HLM、m5HLM、m7HLM，其比活相对于野生型分别提高了40.32％、126.15％、79.80％，有效提升了人源溶菌酶的杀菌效果，对将其用于生产具有高活力抑菌功能的饲料添加剂具有积极作用。本发明所述的基因工程改造的人源溶菌酶不仅对致病菌具有较强的杀灭和抑制作用，同时还具有广谱抗菌的优点，由于抑菌的高效性和对人体的安全性高，也适合于各种食品的防腐。

本发明采用毕赤酵母表达系统可以获得高表达量、高活性的人源溶菌酶，不受原材料来源的限制，克服了以其它方式获取溶菌酶的成本高、表达量低和比活低的缺点。高比活、低成本溶菌酶的生产与推广应用，不仅可对饲料畜牧业的发展产生可观的经济效益和社会效益，同时也可产生巨大的生态效益。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。