本发明公开了一种精氨酸脱羧酶突变体及其在生产胍基丁胺中的应用,属于生物技术领域。本发明提供了受产物抑制影响小的精氨酸脱羧酶突变体I534D和D535W,其中,精氨酸脱羧酶突变体I534D是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型精氨酸脱羧酶的第534位异亮氨酸突变为天冬氨酸得到的,其半抑制常数可达0.66mol/L,较野生型精氨酸脱羧酶提高了5.5倍;精氨酸脱羧酶突变体D535W是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型精氨酸脱羧酶的第535位天冬氨酸突变为色氨酸得到的,其半抑制常数可达0.50mol/L,较野生型精氨酸脱羧酶提高了4.2倍。

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种受产物抑制影响小的精氨酸脱羧酶(arginine decarboxylase,ADC,EC #)。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一种精氨酸脱羧酶突变体，所述精氨酸脱羧酶突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的精氨酸脱羧酶相比，第534位异亮氨酸突变为了天冬氨酸，命名为I534D；

或者，所述精氨酸脱羧酶突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的精氨酸脱羧酶相比，第535位天冬氨酸突变为了色氨酸，命名为D535W。

在本发明的一种实施方式中，编码所述精氨酸脱羧酶的基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明还提供了一种基因，所述基因编码上述精氨酸脱羧酶突变体。

本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带上述基因。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的表达载体为pET-28a(+)质粒或pXMJ19质粒。

本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞携带上述基因或上述重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)或大肠杆菌(Escherichia coli)。

本发明还提供了一种生产胍基丁胺的方法，所述方法为先将上述精氨酸脱羧酶突变体或上述宿主细胞添加至含有L-精氨酸的转化体系中进行转化，得到转化液，然后从转化液中分离得到胍基丁胺。

在本发明的一种实施方式中，所述转化的条件为温度为35～40℃、pH为8.0～9.0。

胍基丁胺是是精氨酸的衍生物。研究表明，胍基丁胺有降血糖、降血压、利尿、抗炎、抗抑郁、抑制细胞增生等生物活性，并且，研究表明，胍基丁胺对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的拮抗作用强而持久，具有对动物吗啡依赖性的戒断作用，是一种极具开发价值的戒毒类药物。因此，胍基丁胺在医药领域市场十分广阔。

目前，工业上主要使用化学合成法和酶转化法这两种方法生产胍基丁胺。其中，化学合成法一般以1,4-丁二胺、己二酸二乙酯、1,4-二溴丁烷和邻苯二甲酰亚胺钾等化合物作为底物，通过还原、取代、胺解和胍基化等化学途径合成胍基丁胺。但是，由于使用化学合成法合成胍基丁胺具有步骤繁琐、产量低下、副产物多以及副产物具有毒性等缺陷，因此，使用化学合成法合成胍基丁胺越来越不被现代工业所接受。

酶转化法则主要是利用精氨酸脱羧酶将L-精氨酸转化为胍基丁胺。与化学合成法相比，利用酶转化法生产胍基丁胺具有步骤简单、副产物少以及绿色环保等优势，但是，由于现有的酶转化法使用的精氨酸脱羧酶存在产物抑制性，在产物胍基丁胺存在的情况下，精氨酸脱羧酶的酶活受到抑制，因此，现有的精氨酸脱羧酶在应用于生产胍基丁胺时常在产量上受到严重的限制。急需找到一种受产物抑制影响小的精氨酸脱羧酶。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

(1)本发明提供了受产物抑制影响小的精氨酸脱羧酶突变体I534D和D535W，其中，精氨酸脱羧酶突变体I534D是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型精氨酸脱羧酶的第534位异亮氨酸突变为天冬氨酸得到的，其半抑制常数可达0.66mol/L，较野生型精氨酸脱羧酶提高了5.5倍；精氨酸脱羧酶突变体D535W是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型精氨酸脱羧酶的第535位天冬氨酸突变为色氨酸得到的，其半抑制常数可达0.50mol/L，较野生型精氨酸脱羧酶提高了4.2倍。

(2)本发明提供了可高效转化L-精氨酸生产胍基丁胺的重组大肠杆菌BL21/pET-28a-speA-1和BL21/pET-28a-speA-2，重组大肠杆菌BL21/pET-28a-speA-1和BL21/pET-28a-speA-2分别以大肠杆菌BL21为宿主，表达精氨酸脱羧酶突变体I534D和D535W；将重组大肠杆菌BL21/pET-28a-speA-1和BL21/pET-28a-speA-2分别添加至含有20g/L L-精氨酸的转化体系中进行转化，转化12h，即可使转化液中胍基丁胺的含量分别高达0.039mol/L和0.029mol/L，L-精氨酸的转化率分别高达68.4％和50.9％。

(3)本发明提供了可高效转化L-精氨酸生产胍基丁胺的重组谷氨酸棒杆菌***和***，重组谷氨酸棒杆菌***和***分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为宿主，表达精氨酸脱羧酶突变体I534D和D535W；将重组谷氨酸棒杆菌***和***分别添加至含有50g/L L-精氨酸的转化体系中进行转化，转化12h，即可使转化液中胍基丁胺的含量分别高达0.251mol/L和0.203mol/L，L-精氨酸的转化率分别高达87.3％和70.8％。

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