一株嘧菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用,属于免疫检测技术领域。本发明公开了一株分泌嘧菌酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC04,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,分类命名为单克隆细胞株,保藏日期2019年11月28日,保藏编号CGMCC No.19175。本发明以嘧菌酯完全抗原免疫BALB/c小鼠,取高效价、低IC50小鼠脾细胞,通过PEG方法与骨髓瘤细胞融合,经过间接竞争酶联免疫法的筛选和三次亚克隆,得到杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体,对嘧菌酯具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.03 ng/mL),为食品中嘧菌酯残留的免疫检测提供了原料,具有实际应用价值。

提供一株嘧菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株制备的抗体对嘧菌酯具有较高的检测灵敏度，可以用来建立嘧菌酯的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株嘧菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC04，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19175。

嘧菌酯单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.19175的杂交瘤细胞株ABC04分泌产生。

本发明提供的嘧菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC04的制备基本步骤为：

（1）半抗原的合成：

嘧菌酯半抗原的合成方案如上式所示。将嘧菌酯（25g，62mmol）加入三口瓶中，加入THF(375mL)，控温30℃以下滴加配好的NaOH溶液(6.8g，170 mmol)25mL，随后升温至68℃反应5h。向反应液中滴加1N的HCl调pH至5，过滤固体，母液用EA萃取2次，有机相合并干燥，旋干溶剂，经硅胶柱纯化，纯化后溶于300mL的DMSO，中压（10 bar）制备色谱，再把产物用EA溶解，采用薄层色谱法得到嘧菌酯半抗原。

（2）完全抗原和包被原的制备：

完全抗原的制备：称取4.5 mg 嘧菌酯半抗原，用200μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后加入6.7 mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，4.0 mg N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应6 h（称为嘧菌酯半抗原活化液）。将钥孔血蓝蛋白 10 mg，用3mL硼酸缓冲溶液溶解（称为蛋白A液），在室温条件，将嘧菌酯半抗原活化液缓慢加入到蛋白A液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得完全抗原；

包被原的制备：称取7.8mg 嘧菌酯半抗原，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，随后加入11.5 mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，6.9 mg N-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应6h（称为嘧菌酯半抗原活化液）。称取10 mg 鸡卵白蛋白OVA，溶解于2mL硼酸缓冲溶液中（称为B液），在室温条件下，将嘧菌酯半抗原活化液逐滴加入到B液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得包被原。

嘧菌酯(Azoxystrobin)，商品名为阿米西达，是由先正达公司开发的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，是一个广谱、高效杀菌剂，具有内吸性传导性好，渗透性强、持效期长等特点，对几乎所有真菌病害都具有保护、治疗和铲除作用，使用方式多样，不但可用于茎叶喷雾，也可用于种子处理和土壤处理。由于嘧菌酯防治病害的范围特别广，可适用于小麦、玉米、水稻等多种粮食作物，花生、棉花、芝麻、烟草等经济作物，番茄、西瓜、黄瓜、茄子、辣椒等蔬菜作物，苹果、梨树、猕猴桃、芒果、荔枝、龙眼、香蕉等果树，以及中药材、花卉等上百种作物。在我国农药检定所登记有400多个制剂，也是登记最多的一个杀菌剂品种。

《GB 2763—2019食品中农药最大残留限量》中规定了嘧菌酯在各种食品中的最大残留限量标准（MRL），如其在稻谷中的MRL为1 mg/kg，在糙米和小麦中的MRL均为0.5 mg/kg，在黄瓜中的MRL为0.5 mg/kg，在马铃薯中的MRL为0.1 mg/kg，以及在柑、橘和橙中的MRL均为1 mg/kg。

为了有效监督监测食品中嘧菌酯的使用情况，需要一种特异性好，灵敏度高的测定方法，而目前检测方法如气相色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法等，其样品前处理过程较为复杂、成本昂贵，加上食品中干扰物较多，因此仪器方法并不适用于现场检测。免疫学检测方法是一种低成本、快速且高灵敏度高特异性的免疫学检测方法，而且操作简便，已广泛适用于药物残留检测领域。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是其重要前提。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

本发明的有益效果：本发明提供的细胞株ABC04分泌的单克隆抗体，对嘧菌酯具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为0.03 ng/mL），可实现对果蔬、谷物中嘧菌酯残留量的检测，为食品中嘧菌酯残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

生物材料样品保藏：一株嘧菌酯单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC04，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19175。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。