本发明涉及一种中链脂肪酸碳链延长功能微生物及其富集方法和应用。本发明以加热预处理后的产酸颗粒污泥为接种菌源,通过在第一阶段高浓度的底物浓度(乙醇、乙酸)进行碳链延长微生物的定向驯化,获得产中链脂肪酸的碳链延长功能微生物种源,继续在第二阶段通过接种白酒废水优化底物浓度和培养初始pH参数,最终获得了一组能够有效氧化乙醇进行碳链延长,生产丁酸、己酸的微生物菌群。该方法可原位富集产酸颗粒污泥中的碳链延长微生物,并实现低值化学品的高度增值,集污染治理和资源利用于一体的应用技术,具有较高的应用价值。

本发明以产酸颗粒污泥为碳链延长功能微生物的环境来源，通过接种白酒废水优化底物浓度和pH条件，成功实现了从污泥中驯化、富集碳链延长功能微生物，并达到中链脂肪酸高效生产的目的。因此，本发明对我国化工、食品和能源等多行业摆脱现有的复杂、高价的化学和酶法等工艺合成中链脂肪酸的困境，具有重要的经济价值和研究意义。

作为本发明的一个方面，提供一种中链脂肪酸碳链延长功能微生物的富集方法，具体包括以下步骤：

(1)预处理产酸颗粒污泥：采集新鲜的产酸颗粒污泥，冷藏保存于4℃冰箱中，摇晃均匀后置于烧杯中进行水浴加热处理，以完全抑制产甲烷菌活性，得到预处理颗粒污泥；

(2)制备颗粒污泥悬液：将步骤(1)制得的颗粒污泥重悬接种到含乙醇和乙酸的德国微生物菌种保藏中心NO.15630标准液体培养基中，得到颗粒污泥悬液；

其中，含乙醇和乙酸的德国微生物菌种保藏中心NO.15630标准液体培养基中包含1～1.5％(v/v)无水乙醇和0.2～0.4％(v/v)乙酸，且其初始pH为6.5～7.0。(3)摇床培养：将步骤(3)制得的颗粒污泥悬液转移至厌氧反应器中，并置于28～30℃、50～60r/min的恒温摇床中进行培养，培养时间30～35d；

(4)制备碳链延长功能微生物种泥：待步骤(3)培养结束后，立即进行固液分离，获得碳链延长功能微生物种泥；

(5)传代培养：将步骤(4)制得的碳链延长功能微生物种泥，接种至乙醇乙酸质量浓度比不低于3：1的白酒废水培养基中，并置于28～30℃、50～60r/min的恒温摇床中进行摇床发酵，发酵时间10～15d，即得高活性和高中链酸生产速率的碳链延长功能微生物发酵液；

其中，白酒废水培养基也可以称为优化天然富集培养基，其包含0.6～1％(v/v)无水乙醇，0.2～0.4％(v/v)乙酸，且其初始pH为7.0～7.5。

碳链延长功能微生物是一类利用电子供体氧化和反向β氧化循环过程，每次循环增加两个碳原子，实现短链挥发性脂肪酸碳链延长，合成中链脂肪酸的厌氧微生物的总称。碳链延长功能微生物能够在常温常压下将多种碳源(例如乙醇、乳酸和合成气等)作为电子供体氧化，为其自身提供生长所需的能量，同时将短链的电子受体如挥发性脂肪酸(例如乙酸、丙酸、丁酸等)转化成中链脂肪酸(如己酸、庚酸、辛酸等)，实现低值化学品的高度增值。其中，常见的电子供体和电子受体为乙醇和乙酸。

随着对碳链延长功能微生物生理生化特征的不断深入研究，人们发现该类功能微生物在环境保护和化工能源等领域都有着重要的应用价值。目前，市售的中链脂肪酸主要来源于椰子等经济植物的提取，也可以通过酶、催化剂催化法化学合成，但工艺复杂，且生产成本较高，工业级己酸价格约17000元/吨，辛酸价格约20000元/吨。基于碳链延长功能微生物的碳链延长技术为中链脂肪酸的生产提供了一个有效的选择，要实现碳链延长，需要提供电子供体和电子受体。一方面，乙醇可以被氧化成乙酰辅酶A作为合成中链脂肪酸的碳源，另一方面氧化过程中释放的能量可以提供碳链延长启动所需的还原当量，这是实现链延长的先决条件。乙酸作为碳骨架接受乙醇氧化产生的电子，和生成的乙酰辅酶A，在碳链延长功能微生物的反向β氧化作用下，每个循环增加两个碳原子，实现碳链的延伸。

目前，绝大多数利用碳链延长微生物实现中链脂肪酸的合成仍处于实验室研究阶段。主要原因如下：首先，碳链延长反应适合开放式培养，需要多种厌氧功能微生物的参与，包括克氏梭菌属(Clostridium)、真杆菌(Eubacteriaceae)、假单胞菌属(Pseudomonas)等，一般多见于白酒、黄酒和醋等发酵工业产生的窖泥或动物的瘤胃中，导致该类功能微生物群落的来源易受到限制，其富集底物的类型具有高度选择性。其次，碳链延长反应易受到功能微生物活性和环境因素的影响，如易受pH和底物浓度的影响，过高或低于最适反应pH(5.2～6.0)，碳链延长反应几乎停止；再如乙醇浓度过高(＞20g/L)，功能微生物的生长受到强烈抑制，但低于2g/L时，碳链延长所需的还原力不足。最后，以乙醇和乙酸生产中链酸的碳转化率低是限制其工程化应用的另一障碍。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

与现有技术相比，本发明所带来的有益效果是：

(1)本发明可从产酸颗粒污泥中原位富集碳链延长功能微生物，解决了现有碳链延长微生物来源受限的问题；

(2)本发明以白酒废水作为天然培养基以优化乙醇浓度和初始pH条件使得碳链延长功能微生物转化生产己酸的能力得到大幅提高，实现了低值化学品的高度增值，并达到了较高的碳转化效率；

(3)本发明对于我国中链脂肪酸生产、能源和环境等多个行业具有较高的市场经济价值。

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