本发明公开了一种过表达GatA基因的重组大肠杆菌及其应用,属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明以述半乳糖醇特有的IIA组分的gatA基因为目的基因,以大肠杆菌为表达宿主,成功构建了一类可广泛应用于制备药品、饲料以及化学品的大肠杆菌工程菌;此大肠杆菌工程菌的衣康酸胁迫抗性得到了显著提高,较野生菌株最高提高了29.4倍,此大肠杆菌工程菌的D 乳酸胁迫抗性得到了显著提高,较野生菌株最高提高了101倍;此大肠杆菌工程菌的琥珀酸胁迫抗性得到了显著提高,较野生菌株最高提高了1.6倍。

本发明提供了一种酸胁迫抗性提高的大肠杆菌工程菌，所述工程菌包含重组质粒；所述重组质粒为连接有目的基因的表达载体；所述目的基因为编码半乳糖醇特有的IIA组分GatA基因。

在本发明的一种实施方式中，所述表达宿主为大肠杆菌***。

在本发明的一种实施方式中，所述半乳糖醇特有的IIA组分GatA来源于大肠杆菌***。

在本发明的一种实施方式中，所述半乳糖醇特有的IIA组分GatA的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码半乳糖醇特有的IIA组分GatA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pTrc99a。

本发明还提供了一种提高大肠杆菌酸胁迫抗性的方法，在大肠杆菌中过量表发半乳糖醇特有的IIA组分GatA。

在本发明的一种实施方式中，所述半乳糖醇特有的IIA组分GatA来源于大肠杆菌***。

在本发明的一种实施方式中，所述半乳糖醇特有的IIA组分GatA的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码半乳糖醇特有的IIA组分GatA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述过量表达为先将编码半乳糖醇特有的IIA组分GatA的基因与表达载体连接，构建含有编码半乳糖醇特有的IIA组分GatA基因的重组质粒，再将重组质粒导入大肠杆菌中。

大肠杆菌是原核生物中一种重要的宿主菌。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。它们不仅是研究生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上具有重要的学术价值，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。目前，已有多种高价值的有机酸生物发酵方法成功应用，其中也有人尝试以大肠杆菌为宿主来表达，但是常常存在酸胁迫的问题。

衣康酸学名为甲叉琥珀酸、亚甲基丁二酸，是不饱和二元有机酸，它含不饱和双键，具有活泼的化学性质，可进行自身间的聚合，也能与其他单体如丙烯腈等聚合，是化学合成工业的重要原料，也是化工生产的重要原料。采用大肠杆菌作为天然宿主时，由于大肠杆菌本身不具备衣康酸代谢能力，起初被报道出来的产量非常低，少于1g·L-1，后来发展到4.3g·L-1。直到最近，可见的报道中，衣康酸最高的产量也仅仅为47g·L-1，其合成途径主要由乌头酸氧化途径产生，从最终的产量上来，仍然与采用曲霉菌属为宿主时的产量有一定差距，其产率为0.86g·h-1·L-1，虽然与传统的曲霉类生产菌属相比，在产量上存在一些不足，但以大肠杆菌作为衣康酸的生产宿主依然可以被认为是具有潜力的。

高光学纯度D-乳酸(97％以上)作为一个手性中心是多种手性物质的前体，是重要的手性中间体与有机合成原料，广泛应用于制药、高效低毒农药及除草剂、化妆品等领域的手性合成，并且D-乳酸也是生物塑料聚乳酸的原料。目前发酵法制备乳酸以其绿色、高效、环保，在工业上具有广泛的应用前景，虽然在大肠杆菌中有固有的乳酸生成途径，可通过乳酸脱氢酶(LdhA)将丙酮酸转化为乳酸，不需要额外引入异源LdhA来产生乳酸，但是由于大肠杆菌系统存在酸胁迫的问题，而制约着乳酸的产量的提高。

目前，提高大肠杆菌的酸胁迫抗性的方法则主要有：(1)诱变育种，该方法具有简便、类型繁多等特点，但工作量大、效率低是其主要缺点，且诱变后的菌种容易退化；(2)代谢工程策略，目前利用代谢工程策略提高大肠杆菌环境胁迫的方法主要包括构建新的代谢途径、拓展已有代谢途径和削弱已有代谢途径，但是，此方法存在成本高、成功率低的问题。

因此，急需找到一种新的效果优异、成功率高、遗传稳定性好、成本低、并且操作简单的可提高大肠杆菌酸胁迫性的方法。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

(1)本发明通过在大肠杆菌中过量表达GatA蛋白，得到了酸胁迫抗性显著提高的重组大肠杆菌***-GatA；本发明的操作简单，可广泛的应用到工业生产中。

(2)利用本发明的方法得到的重组大肠杆菌***-GatA对酸胁迫抗性较对照菌株有了明显的提高，其对衣康酸的抗性是对照菌株的29.4倍；其对D-乳酸的抗性是对照菌株的101倍；其对琥珀酸的抗性是对照菌株的1.6倍。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。