本发明提供了中性脲酶固定化及其在降解黄酒尿素中的应用,属于发酵工程技术领域。本发明以安全无毒的壳聚糖和氧化海藻酸钠分别作为载体和交联剂,采用共价结合法对植物来源的中性脲酶进行固定化,使获得的固定化中性脲酶耐酸性有显著提高。将此固定化中性脲酶处理黄酒,分批处理可有效减除黄酒中约98%的尿素。该方法使对黄酒中尿素的降解基本没有作用的中性脲酶,成为可替代酸性脲酶,可作为用于黄酒中尿素降解的酶制剂。且固定化酶便于回收,可重复利用,在黄酒中基本没有残留。可以安全有效地降低黄酒尿素的含量,从而控制黄酒中氨基甲酸乙酯的含量,为保障黄酒的安全性提供了新的途径。

(1)壳聚糖载体的制备：称取壳聚糖2.5-3.5g，溶于100mL 2％的乙酸中，搅拌均匀后，静置1h脱气；凝结液的制作：10％的NaOH与20％的无水乙醇混合制得；用注射器将壳聚糖溶液滴入凝结液中形成微球，凝结一段时间后用去离子水洗涤微球至中性，滤干；

(2)脲酶的固定化：称取一定量壳聚糖微球，与无毒性的氧化海藻酸钠溶液进行交联，其中微球质量：交联剂体积比(g/mL)为1：2，在200r/min的震荡交联1-5h，洗涤除去残留的交联剂溶液；交联后的微球与0.1-0.2mg/mL的酶液在4℃下静置6-10h进行固定化；洗涤微球至表面无游离酶，所得固定化酶贮存在4℃备用。

本发明还保护所述制备固定化中性脲酶的方法制备得到的固定化脲酶在降解黄酒尿素中的应用。

本发明还保护所述提高中性脲酶对酸性条件耐受性的方法，或降解黄酒中尿素的方法在降解黄酒尿素中的应用。

基甲酸乙酯(Ethyl carbamate或Urethane，简称EC)，是一种具有遗传毒性及较强致癌性的物质，天然存在于多种发酵食品(如酱油、食醋、泡菜)和酒精饮料(如黄酒、白酒、葡萄酒、日本清酒、白兰地)中。2007年国际癌症研究机构IARC(the InternationalAgency for Research on Cancer)将EC归类为2A类致癌物。在酒精饮料中，我国传统黄酒中的EC含量相对较高，这不仅限制了我国黄酒的出口，同时也引起人们对其长期饮用所存在的安全方面的担忧。

研究发现，黄酒中的尿素是EC的主要前体物质，90％左右的EC是由尿素和乙醇经化学反应生成的，因此控制黄酒中的尿素含量对于控制EC的生成具有重要意义。关于黄酒中尿素的控制，目前已有一些方法报道，其中利用脲酶是较为直接、简便的方法。但是由于黄酒的酸性环境(pH 4.0左右)，国内外大部分研究者主要对酸性脲酶研究较多。虽然酸性脲酶对黄酒中尿素的降解有一定的效果，但酸性脲酶目前只有日本和美国的少数企业实现工业化生产，其进口和使用的安全性问题在国内都有一定的限制。而国内对酸性脲酶的研究还停留在实验研究阶段，尚无商业化酸性脲酶供应，这就大大限制了酸性脲酶处理黄酒的工业化应用。目前有实审阶段申请专利“食品级脲酶、制备方法及其在黄酒中的应用”(专利号201810670334.8)公开了脲酶在黄酒中的应用，但该专利并未公开食品级脲酶的来源和性质以及在是否真的能够应用于黄酒中。

我国目前市售的商品脲酶，基本上是植物来源的中性脲酶，其价格便宜，来源广泛。但该酶在在酸性条件下酶活很低，一般认为这种中性脲酶不适合用于黄酒中尿素的降解。近几年国内外对脲酶的固定化研究表明，固定化可以提高脲酶的稳定性和利用效率，但关于中性脲酶的研究很少。有报道利用固定化中性脲酶处理黄酒，需将黄酒pH调至4.8以降低其中的尿素含量。但中性脲酶固定化后是否可以在不改变黄酒特性的条件下用于黄酒中尿素的降解，目前鲜有相关研究报道。

综上，目前尚没有文献或专利公开利用安全可靠的固定化中性脲酶直接用于黄酒中降解尿素的方法。

江南大学是教育部直属、国家“211工程”重点建设高校和“双一流”建设高校。学校具有悠久的办学历史、厚重的文化积淀，源起1902年创建的三江师范学堂，历经国立中央大学、南京大学等发展时期；1958年南京工学院食品工业系整建制东迁无锡独立建校，成立无锡轻工业学院；1962年无锡纺织工学院并入无锡轻工业学院；1995年更名为无锡轻工大学；2001年无锡轻工大学、江南学院、无锡教育学院合并组建江南大学；2003年东华大学无锡校区并入江南大学。

本发明以安全无毒的壳聚糖和氧化海藻酸钠分别作为载体和交联剂，采用共价结合法对植物来源的中性脲酶进行固定化，使获得的固定化中性脲酶耐酸性及活力均有显著提高，固定化脲酶对酸性条件可耐受的pH为3.5-4.0。目前的中性脲酶对黄酒中的尿素基本没有降解作用，而将本发明制备得到的固定化中性脲酶应用于处理黄酒中，单批次处理黄酒24h后，黄酒中尿素含量低于0.5mg/L；分批处理可有效减除黄酒中98％的尿素；并且还可将其装柱，对黄酒进行连续处理。由于固定化中性脲酶所具备的这些性质，使得其可以替代酸性脲酶，作为用于黄酒中尿素降解的酶制剂。而且固定化酶便于回收，可重复利用，在黄酒中基本没有残留。该方法在不改变原酿造酒工艺的条件下，可以将目前国内已有的、来源广泛的植物中性脲酶运用起来，从而安全有效地降低黄酒尿素的含量、并控制黄酒中氨基甲酸乙酯的含量，为保障黄酒的安全性提供了新的途径。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。