本发明公开了一种促进谷氨酸棒杆菌发酵生产目标产物的方法,属于基因工程技术领域。本发明以谷氨酸棒杆菌为宿主,敲除了其葡萄糖 6 磷酸脱氢酶编码基因zwf和苹果酸酶基因malE,同时将其NADP+依赖型异柠檬酸脱氢酶编码基因icdcg替换为变形链球菌的NAD+依赖性异柠檬酸脱氢酶编码基因icdsm,获得了一株NADPH营养缺陷型谷氨酸棒杆菌。接着,在上述菌株中使用不同强度的启动子过表达大肠杆菌中烟酰胺核苷酸转氢酶PntAB编码基因pntAB,得到不同NADPH再生强度的重组菌株,筛选得到高产目标产物的重组菌,可实现目标产物合成途径的精细化调控。

本发明通过失活葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Zwf)和苹果酸酶(MalE)，并将NADP+依赖型异柠檬酸脱氢酶(Icdcg)替换成变形链球菌(Streptococcusmutans)中NAD+依赖型异柠檬酸脱氢酶(Icdsm)，从而阻断谷氨酸棒杆菌胞内所有参与NADPH合成途径，先构建了一株NADPH营养缺陷型谷氨酸棒杆菌。接着通过在上述菌株中使用不同强度的启动子表达大肠杆菌中PntAB，获得不同NADPH再生水平的重组菌株，可筛选能够高产目标产物的重组菌，可实现目标产物合成途径的精细化调控。

本发明的第一个目的是提供一种促进谷氨酸棒杆菌发酵生产目标产物的方法，包括如下步骤：

S1、构建NADPH营养缺陷型谷氨酸棒杆菌：以生产目标产物的谷氨酸棒杆菌为宿主，敲除了其葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因zwf和苹果酸酶基因malE，同时将其NADP+依赖型异柠檬酸脱氢酶编码基因icdcg替换为变形链球菌的NAD+依赖性异柠檬酸脱氢酶编码基因icdsm；

S2、构建重组质粒：设计不同强度的启动子序列，将烟酰胺核苷酸转氢酶基因连接到质粒上获得目的重组质粒，将目的重组质粒的启动子分别替换为不同强度的启动子，获得重组表达质粒；

S3、将重组表达质粒导入S1步骤构建的NADPH营养缺陷型谷氨酸棒杆菌中，筛选得到目标产物产量提高的重组菌。

NADPH又叫还原型辅酶Ⅱ，是一种重要的辅因子，在细胞内广泛分布，通过参与800对个氧化还原反应来调节胞内氧化还原水平并影响众多基因表达、细胞功能、代谢途径、物质跨膜运输和胞内微环境。胞内NADPH水平与目标代谢产物的合成之间的关系可分为以下几种类型：(1)影响目标代谢产物产量：提高胞内NADPH水平，能促进胞内NADPH-依赖型产物的合成而阻断非NADPH-依赖型产物的合成；(2)影响底物转化率：调控胞内NADPH水平，能有效降低副产物积累，提高原料的转化率；(3)影响目标代谢产物生产强度：增加胞内NADPH供给，满足中心碳代谢途径中关键酶对NADPH的需求，可实现目标产物高强度生产；(4)拓宽底物利用范围：促进胞内NADPH再生，可提高菌体对糖蜜、羧基化合物等的利用；(5)影响胞内微环境：改变NADPH水平会影响胞内NAD(H/+)状态和ATP含量，可调节胞内pH(pHi)和活性氧簇(ROS)的形成，提高细胞对酸胁迫和氧胁迫的适应力。因此，对胞内NADPH水平的调控是菌种改造和发酵过程优化需考虑的一个重要指标。

目前，内源调控是调节胞内NADPH水平的常用策略，谷氨酸棒杆菌没有转氢酶循环途径，只有由丙酮酸/磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸酶和苹果酸脱氢酶(MalE,编码基因malE)组成的类似转氢酶循环(Transhydrogenase-Like Cycle)途径，苹果酸酶可将NADH转化为NADPH，提高胞内NADPH供给水平，促进目的产物合成。虽然上述代谢改造取得了比较显著的成果，但还存在以下不足：辅因子NADPH调控微生物细胞生理代谢功能的机制还不清晰，进而难于通过控制胞内NADPH水平实现目标产物合成途径的精细化调控。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

本发明以谷氨酸棒杆菌为宿主，敲除了其葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因zwf和苹果酸酶基因malE，同时将其NADP+依赖型异柠檬酸脱氢酶编码基因icdcg替换为变形链球菌的NAD+依赖性异柠檬酸脱氢酶编码基因icdsm，获得了一株NADPH营养缺陷型谷氨酸棒杆菌。接着，在上述菌株中使用不同强度的启动子过表达大肠杆菌中烟酰胺核苷酸转氢酶PntAB编码基因pntAB，得到不同NADPH再生强度的重组菌株，筛选得到高产目标产物的重组菌，可实现目标产物合成途径的精细化调控。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。