本发明公开了一种基于异源群体感应的高效表达系统,属于基因工程技术领域。本发明通过将金黄色葡萄球菌的agr群体感应系统中的agrA、agrB、agrC和agrD基因异源构建至枯草芽孢杆菌168基因组,将P3启动子克隆至穿梭载体,进而构建相配套的宿主和表达质粒。使用绿色荧光蛋白sfGFP作为报告基因,证明该系统可以高效表达外源蛋白,且不需要额外添加诱导剂。分别对P3启动子在RepA、RepB和RepF复制类型质粒上的蛋白表达水平进行检测,表明其与强组成型启动子P43和PylbP相比,在RepA和RepF复制类型质粒上具有超高的活性。

(1)将编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的启动子P3，或上述核苷酸序列a～j任一所示任一所示的P3突变体、标记物基因、目的基因依次连接在载体上，构建重组载体；

(2)将编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的agrB基因、SEQ ID NO.6所示的agrC基因和编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的agrA基因依次连接在枯草芽孢杆菌的染色体上的启动子P43之后，将编码核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的agrD基因连接在枯草芽孢杆菌的染色体上的启动子Pveg之后，构建宿主细胞；

(3)将步骤(1)的载体导入步骤(2)的宿主细胞中得到重组细胞。

本发明还提供了一种调控目的基因表达的方法，所述方法为，将上述重组枯草芽孢杆菌接种至培养基中，培养菌体细胞，检测荧光蛋白表达量，通过荧光蛋白表达量的强弱，以达到调控目的基因的效果。

在本发明的一种实施方式中，将上述重组枯草芽孢杆菌接种至含有相应抗性的LB固体培养基上划线，挑取单菌落接种至含有5mL LB液体培养基的试管中，在200r·min-1，37℃培养12h，得到种子液；然后按2％(v/v)的接种量将种子液转接入含有5mL LB液体培养基以及AIP的试管中，在37℃，200rpm条件下培养。

本发明还提供了上述表达系统，或上述重组细胞在调控目的基因表达中的应用。

枯草芽孢杆菌已经被广泛用于酶制剂生产领域，多种枯草芽孢杆菌蛋白表达系统已经被开发出来。根据蛋白表达的调节类型，主要有三类：①组成型表达系统；②诱导型表达系统；③自诱导型表达系统。组成型表达系统的蛋白表达时间和强度无法得到有效控制；诱导型表达系统需要在发酵过程中添加额外的诱导剂，增加了操作复杂度和发酵生产成本；自诱导系统主要利用碳代谢阻遏效应中碳源的切换来实现，限制了发酵培养基的成份。

微生物(包括酵母等真核生物和细菌等原核生物)能够产生并释放特定的信号分子到生长环境中，被同类微生物所感知，并通过这些信号分子的浓度变化调控微生物的群体行为，这种调控系统称为群体感应(Quorum-Sensing，QS)。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌通常分别以寡肽类物质(Auto-inducing peptide，AIP)和酰基高丝氨酸环内酯类物质(Acyl-homoserine lactone，AHL)作为QS系统的信号分子。信号分子的产生和积累随细胞的生长逐步进行，达到一定浓度阈值时激活QS系统。因此QS系统对基因表达的调控实际与细胞密度偶联。由于具备细胞密度响应的特性，近年来，普遍认为利用群体感应调控构建高效蛋白表达系统极具应用前景。

枯草芽孢杆菌也有内源的群体感应系统(如comQS系统)，其与枯草芽孢杆菌对生长环境压力的适应相关，直接调节蛋白酶表达、感受态细胞形成和芽孢的产生。利用枯草芽孢杆菌内源群体感应系统高效表达外源蛋白已有报道，但是，若利用枯草芽孢杆菌内源QS系统对基因表达进行调控，将会严重影响其本身细胞生长、感受态形成及芽胞产生等重要的生理过程。

金黄色葡萄球菌agr系统(agrQS)是目前革兰氏阳性菌中研究最为透彻的群体感应系统，其负责基因表达调控的关键元件包含：编码AIP前体的基因agrD，加工AIP合成的基因agrB，感受AIP浓度信号的agrC及受AgrC磷酸化激活的转录因子agrA和效应启动子P3。可以利用金黄色葡萄球菌agr系统agrQS在枯草芽孢杆菌中构建基于异源群体感应的高效蛋白表达系统，但是如何能将该系统在枯草芽孢杆菌中顺利的构建基于异源群体感应的高效蛋白表达系统是研究的难点。

江南大学是教育部直属、国家“211工程”重点建设高校和“双一流”建设高校。学校具有悠久的办学历史、厚重的文化积淀，源起1902年创建的三江师范学堂，历经国立中央大学、南京大学等发展时期；1958年南京工学院食品工业系整建制东迁无锡独立建校，成立无锡轻工业学院；1962年无锡纺织工学院并入无锡轻工业学院；1995年更名为无锡轻工大学；2001年无锡轻工大学、江南学院、无锡教育学院合并组建江南大学；2003年东华大学无锡校区并入江南大学。

本发明将金黄色葡萄球菌agrQS中基因表达调控关键元件异源构建至枯草芽孢杆菌中，构建基于异源群体感应的表达系统，可高效的调控目的蛋白的表达。本发明通过将启动子P3构建至RepA、RepB和RepF不同复制类型的质粒上，并且使用sfGFP、纳豆激酶和普鲁兰酶进行表达验证。结果发现，该表达系统在不同复制类型质粒上都能高效表达蛋白，尤其是在RepA和RepF复制类型质粒上，其蛋白表达水平远高于由强组成型启动子P43和PylbP构成的表达系统。本发明所提供的异源群体感应的表达系统尤其对于在RepA和RepF复制类型的低拷贝质粒上高效表达蛋白具有重要意义。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。