本发明公开了一种类大牻牛儿烯合成酶C突变体及构建方法与应用,属于生物催化技术领域。本发明采用重组DNA技术将类大牻牛儿烯合成酶C编码基因,将其克隆至表达载体,并转化宿主,获得一株高产类大牻牛儿烯合成酶C的重组菌株。针对类大牻牛儿烯合成酶C活性位点E474周围loop结构上的氨基酸残基进行定向进化,筛选获得高活性类大牻牛儿烯合成酶C突变体。本发明还提供了上述方法在制备含西柏三烯醇的产品中的应用。采用本发明获得的高活性类大牻牛儿烯合成酶C突变体及方法可高效催化生产西柏三烯醇,可促进其在农业及烟草等领域中的应用。

本发明的第二个目的是提供一种类大牻牛儿烯合成酶C突变体，所述的类大牻牛儿烯合成酶C突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亲本的第474位范围内的loop结构上的氨基酸残基进行突变得到。

进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亲本的第471位的组氨酸突变为甘氨酸、丙氨酸或赖氨酸，或者第472位的谷氨酸突变为甘氨酸、丙氨酸或天冬氨酸，或者将473位的缬氨酸突变为甘氨酸、丙氨酸或异亮氨酸，或者将第475位的谷氨酰胺突变为天冬酰胺，或者将476位的谷氨酰胺突变为天冬酰胺、甘氨酸或丝氨酸，或者将第477位的精氨酸突变为赖氨酸或甘氨酸，或者将第478位的甘氨酸突变为脯氨酸，或者将第479位的组氨酸突变为甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸或精氨酸。

在全球杀虫剂市场的背景下，化学合成的活性化合物，如人造除虫菊衍生物和最显着的新烟碱类(如吡虫啉、噻虫嗪和噻虫胺；价值18.9亿美元)，其可快速作用害虫但非目标判别产品。新烟碱类是通过与烟碱乙酰胆碱受体不可逆结合而介导所有昆虫神经毒性作用的主要杀虫剂类别。化学农药具有诸多缺点，例如：易造成环境污染、目标种群逐渐养成抗药性、其对非目标种群具有负面性等。因此，这些化合物会影响害虫以及蜜蜂和熊蜂等有益昆虫，从而对农村地区的农作物和生物多样性的授粉产生负面影响。化学杀虫剂甚至危及工业农业活动和仍在增长的人口的可持续性。此外，这些化学品的生物降解性很差，导致环境积累，对陆地和水生生态系统的生物多样性产生负面影响。新烟碱类的广泛环境影响最近引发欧洲委员会严格限制这些化合物在农业活动中的适用性。

生物农药亦称为天然农药，是来自天然的化学物质或者生命体，具有杀菌农药和杀虫农药的作用。相比而言，生物农药具有诸多优点：选定的天然杀虫化合物对脱靶昆虫无毒、确保仅对农业活动和作物产量产生积极影响、对人畜安全、对生态环境影响小、诱发害虫患病、可利用农副产品加工生产、易被陆地微生物或光迅速降解、不会积累等。我国生物农业类型主要包括微生物农药、植物源农药、农用抗生素、天敌昆虫农药、生物化学农药、植物生长调节剂类农药等六大类型。西柏三烯醇作为一种重要的二萜类化合物，是植物的分泌物成分，代表植物防御昆虫、病原微生物和食草动物的主要成分，在生物防治方面具有重要作用与意义。西柏三烯醇只能在植物中以痕量检测到，但其具有显著的杀虫活性，且在自然降解过程中不会在生态圈中积累。

同时，西柏三烯醇也是烟草中香味物质之一，对于烟草的品质具有重要影响与作用意义。虽然近年来西柏三烯醇受到了一定关注，但相关报道与数据较少。西柏三烯醇可以从植物中提取获得，但由于其在植物中只能以痕量检测到，含量较少。所以，通过从植物中提取的方法获得西柏三烯醇具有一定的挑战，且生产成本太高，不利于其在农业生产中的应用。来自烟草的类大牻牛儿烯合成酶C可以催化底物GGPP生产获得西柏三烯醇，该酶结构中含有较多的天冬氨酸的DDXXD和(N,D)DXX(S,T)XXXE序列，同时含有镁簇结构。但是目前类大牻牛儿烯合成酶C活性较低，生物催化效率较低，不利于工业生产的应用。

江南大学是教育部直属、国家“211工程”重点建设高校和“双一流”建设高校。学校具有悠久的办学历史、厚重的文化积淀，源起1902年创建的三江师范学堂，历经国立中央大学、南京大学等发展时期；1958年南京工学院食品工业系整建制东迁无锡独立建校，成立无锡轻工业学院；1962年无锡纺织工学院并入无锡轻工业学院；1995年更名为无锡轻工大学；2001年无锡轻工大学、江南学院、无锡教育学院合并组建江南大学；2003年东华大学无锡校区并入江南大学。

生物催化在重要化学品等的生产过程中具有重要作用与意义。通过生物催化方法高效生产西柏三烯醇，可显著增加其产量，提高其生产效率等本发明采用重组DNA技术将类大牻牛儿烯合成酶C编码基因，将其克隆至表达载体，并转化宿主，获得一株高产类大牻牛儿烯合成酶C的重组菌株。针对类大牻牛儿烯合成酶C活性位点E474周围loop结构上的氨基酸残基进行定向进化，筛选获得高活性类大牻牛儿烯合成酶C突变体。本发明还提供了上述方法在制备含西柏三烯醇的产品中的应用。采用本发明获得的高活性类大牻牛儿烯合成酶C突变体及方法可高效催化生产西柏三烯醇，可促进其在农业及烟草等领域中的应用。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。