本发明公开了枯草芽孢杆菌人工终止子及其应用,属于基因工程技术领域。本发明首先对不同的终止子的活性进行表征,接下来使用不同终止子测定平台对终止子的终止次效率进行测定,得到了一系列可提高目的蛋白产量的新型终止子,以绿色荧光蛋白基因作为终止子上游基因,以红色荧光蛋白基因作为终止子下游基因,表征终止子对上下游基因的调控水平。结果表明,这些新型终止子对于提高上游基因表达量和抑制下游基因表达量都有良好的效果。将一系列不同终止子应用于纳豆激酶和普鲁兰酶重组蛋白表达中,结果表明,这些终止子有助于提高蛋白的酶活和蛋白表达量的提升,这对在枯草芽孢杆菌中生产目的蛋白具有重要的应用价值。

上述终止子在基因表达中的应用，所述应用为，将终止子置于需表达的基因的下游，与基因共表达。

在本发明的一种实施方式中，所述基因为编码纳豆激酶的基因，或编码天冬氨酸裂解酶的基因。

本发明还提供了一种含有上述元件的载体。

本发明还提供了表达上述载体的基因工程菌。

本发明还提供了一种调控枯草芽孢杆菌中目的蛋白表达的方法，将上述元件与目的蛋白基因共表达。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括Bacillus subtilis 168、Bacillus subtilis WB400、Bacillus subtilis WB600或Bacillus subtilis WB800。

在本发明的一种实施方式中，所述目的蛋白包括酶。

本发明还提供了上述的调控元件或基因工程菌在制备目的蛋白中的应用。

本发明还提供了上述的调控元件或基因工程菌在食品、制药或化工领域的应用。

转录终止子是位于基因或操纵子的下游，负责RNA聚合酶的解离和释放出转录的RNA从而起到终止转录的一段RNA序列。在原核生物中，转录终止子有两种类型，一种是蛋白因子依赖型，需要在蛋白因子的辅助下才能发挥作用，且消耗ATP；另一种是不依赖任何蛋白因子，仅依赖其自身的反向回文序列和poly-U形成的发夹结构发挥作用，也称为内在终止子。转录终止子由于其特殊的二级结构，常位于基因的3’端，因此在维持mRNA稳定性和提高mRNA的半衰期方面起到重要作用。终止子终止转录是使RNA聚合酶脱离转录复合物，可提高RNA聚合酶的利用效率，也能提高基因的表达量。之前，对于终止子的研究主要集中在大肠杆菌当中，只有小部分文献提及在其他微生物中的应用，如酿酒酵母等。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主。因此，提供一种能够调控枯草芽孢杆菌中基因表达、稳定、高活性的终止子，对于制备目的蛋白，尤其是食品领域中用到的蛋白，具有重要的应用价值，因此如何得到一种高效的、兼容性好的、可调节蛋白表达的枯草芽孢杆菌人工终止子系统成为研究的热点。

江南大学是教育部直属、国家“211工程”重点建设高校和“双一流”建设高校。学校具有悠久的办学历史、厚重的文化积淀，源起1902年创建的三江师范学堂，历经国立中央大学、南京大学等发展时期；1958年南京工学院食品工业系整建制东迁无锡独立建校，成立无锡轻工业学院；1962年无锡纺织工学院并入无锡轻工业学院；1995年更名为无锡轻工大学；2001年无锡轻工大学、江南学院、无锡教育学院合并组建江南大学；2003年东华大学无锡校区并入江南大学。

本发明首先对单终止子的活性进行表征，发现添加T31终止子比不添加终止子时，上游GFP表达量提高了1.98倍，下游mcherry表达量降低了33.8倍。以绿色荧光蛋白基因作为终止子上游基因，以红色荧光蛋白基因作为终止子下游基因，表征终止子对上下游基因的调控水平。结果表明，这些终止子对于抑制下游基因表达量都有很好的效果，如添加终止效率最低的T42终止子时，比对照的下游mcherry表达量下降了1.43倍。将本发明中的终止子放在不同的基因环境中，所测得的终止效率几乎不变，且同样可以达到抑制下游基因表达量的目的。通过将不同终止强度的终止子作为基因表达的3’端元件，得到了不同表达量的目的蛋白，这对在枯草芽孢杆菌中生产目的蛋白具有重要的应用价值。

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