本发明公开了高特异性生产麦芽三糖的麦芽三糖淀粉酶突变体,属于基因工程和酶工程领域。本发明对来源于Thermobifidafusca NTU22的TfAmyA进行改造,对TfAmyA进行了一项截短和,并在此基础上对47位的亮氨酸,101位的甘氨酸,103位的甘氨酸,153位的甘氨酸,进行定点突变。获得的突变体酶的主产物麦芽三糖的特异性增加,产率增加,更适用于麦芽三糖的生产。

为了解决目前存在的问题，本发明提供了麦芽三糖淀粉酶突变体。本发明所使用的来源于Thermobifidafusca NTU22的麦芽三糖淀粉酶TfAmyA在酶转化反应初期就产生了G1-G3的产物，属于一种内切酶，这降低了TfAmyA生产G3时对底物的得率，同时也增加了分离纯化的难度。因此，进一步提高该酶的产G3能力与特异性有利于G3生产成本的降低与规模化生产。

本发明提供了一种高特异性生产麦芽三糖的麦芽三糖淀粉酶突变体，是相对于亲本TfAmyA在羧基末端截短，或截短的突变体氨基酸的第47位、第101位、第103位、第153位任一位点的氨基酸发生突变。

在本发明的一种实施方式中，所述亲本TfAmyA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为以下(a)～(e)任一：

(a)将亲本的第451-572位氨基酸截去，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(b)将序列如SEQ ID NO.4所示氨基酸的第47位的亮氨酸突变为赖氨酸或精氨酸，分别将突变体命名为L47K、L47R；

(c)将序列如SEQ ID NO.4所示氨基酸的第101位的甘氨酸突变为丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、或谷氨酰胺，分别将突变体命名为G101S、G101T、G101D、G101N、G101E、G101Q；

(d)将序列如SEQ ID NO.4所示氨基酸的第103位的甘氨酸突变为组氨酸，将突变体命名为G103H；

(e)将序列如SEQ ID NO.4所示氨基酸的第153位的甘氨酸突变为丝氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺或组氨酸，分别将突变体命名为G153S、G153D、G153N、G153E、G153Q、G153H。

本发明提供了编码所述突变体的基因。

麦芽三糖(Maltotriose，α-D-Glc-(1→4)-α-D-Glc-(1→4)-D-Glc，简称G3)属于一种功能性低聚糖，由三个葡萄糖单元经α-(1→4)糖苷键连接而成。其分子式为C18H32O16，相对分子质量为504.438，密度为1.8±0.1g·cm-3，熔点为132-135℃，常温下为白色固体粉末。G3具有多种优异的物理化学和生理学性质，其是可消化的营养甜味品，具有非致龋、低甜度、低粘度、低热量、抗结晶和低渗透压的特点，可用于改变冷冻食品的冷冻温度，并控制热加工食品中美拉德反应引起的褐变量。G3提供高保湿能力，防止过度干燥和低水分活度，便于控制微生物污染，具有强稳定性，是淀粉回生的强抑制剂。G3在食品、饮料、化工、医药等行业应用广泛。

目前G3的制备工艺分为化学法和酶法两种。化学法以普鲁兰多糖为起始原料，通过乙酰解、脱乙酰基两个步骤即可制备G3。在两步反应中，需要用到浓硫酸、石油醚、甲醇和甲醇钠等高危试剂，虽然步骤简短、操作简单，但是底物成本高、环境危害大。酶法作为一种绿色节能高效安全的替代方法可显著降低生产成本、提高产品品质、满足大众消费需求，是推动麦芽三糖产业可持续发展的原动力。因为所用酶的不同，酶法制备又分为两种。酶法制备因为所用酶的不同又分为两种。第一种酶法是通过普鲁兰酶水解普鲁兰多糖，可连续化、自动化制备医药级的G3(纯度99％以上)，但是这种方法存在着底物成本高的问题。与普鲁兰多糖相比，淀粉是一种丰富的天然可再生资源，是许多重要粮食作物(如大米、玉米、小麦、水稻、马铃薯和木薯)的种子、根或块茎中的主要储存碳水化合物，更加经济实惠。麦芽糊精是淀粉糊化后添加α-淀粉酶的液化产物。因α-淀粉酶的作用，麦芽糊精的聚合度低，溶解度大，有利于其他酶进行作用。第二种方法就是以AmyA作为主要用酶，以淀粉或麦芽糊精等廉价原料作为底物生产G3。通常而言，在反应体系中还需添加普鲁兰酶进行脱支作用。但是目前AmyA存在着副产物葡萄糖和麦芽糖多的问题，增加了分离纯化的难度和成本。因此，通过分子改造等手段获得高G3特异性的AmyA，可提高G3产量，简化生产工艺，降低生产成本。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

本发明还保护所述突变体，或所述基因，或所述重组表达载体，或所述微生物细胞，或提高麦芽三糖生产特异性的方法在制备麦芽三糖中的应用。

本发明的有益效果：本发明通过对TfAmyA进行截短突变及定点突变，获得了多种突变体，麦芽三糖淀粉酶的活力增强；产物中麦芽三糖的比例提高，有利于简化麦芽三糖的后续纯化工艺与实现规模化生产，并且能显著降低麦芽三糖的生产成本，具备广泛的工业化应用前景。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。