本发明公开了一种梯度稀释液及其在双歧杆菌计数中的应用,属于微生物技术领域。本发明提供了一种可显著提高双歧杆菌在被梯度稀释时的存活率的梯度稀释液,此梯度稀释液的成分包含L 半胱氨酸盐酸盐、吐温80、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和氯化钠;使用此梯度稀释液配合平板活菌计数法检测双歧杆菌菌粉中的双歧杆菌活菌数时,测得的活菌数高达2.0×1010CFU/g以上,而使用常规梯度稀释液(例如,生理盐水、缓冲液、无菌水和蛋白胨水等)配合平板活菌计数法检测双歧杆菌菌粉中的双歧杆菌活菌数时,测得的活菌数在2.0×1010CFU/g以下⊙

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种可显著提高双歧杆菌在被梯度稀释时的存活率的梯度稀释液。

[技术方案]

为解决本发明的技术问题，本发明提供了一种梯度稀释液，所述梯度稀释液的成分包含抗氧化剂0.5～1g/L、表面活性剂0.5～1g/L、磷酸盐10～15g/L和无机盐1～5g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述抗氧化剂为L-半胱氨酸盐酸盐和/或维生素C；所述表面活性剂为吐温80；所述磷酸盐为磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和/或磷酸二氢钠；所述无机盐为氯化钠和/或氯化钾。

在本发明的一种实施方式中，所述梯度稀释液的成分包含L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L、吐温800.6g/L、磷酸氢二钠6g/L、磷酸二氢钾4.5g/L和氯化钠5g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述梯度稀释液的pH为6.2～7.0、渗透压为280～320Pa。

在本发明的一种实施方式中，所述梯度稀释液的pH为7.0、渗透压为300。

发明还提供了一种对双歧杆菌进行计数的方法，所述方法为将含有双歧杆菌的待测样品用上述梯度稀释液进行稀释，得到稀释液；对稀释液进行活菌计数。

在本发明的一种实施方式中，所述含有双歧杆菌的待测样品为双歧杆菌菌粉。

在本发明的一种实施方式中，所述双歧杆菌为长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌和/或两歧双歧杆菌。

双歧杆菌(Bifidobacterium)是人体所必需的益生菌之一，对人体有着很多益生作用，例如，促进人体对矿物质的吸收；维持人体肠道微生物平衡，抑制人体肠道内致病菌的生长；增强人体免疫机能，降低人体罹患癌症、肥胖、糖尿病、胃肠疾病等疾病的风险；降低人体胆固醇水平；治疗炎症；抗肿瘤；改善人体对乳制品的耐乳糖性，提高人体对乳制品的消化率等。

由于具有显著的益生功效，双歧杆菌越来越成为人们研究、开发、生产的重点。目前，双歧杆菌已被广泛地应用于食品、医药等领域。

双歧杆菌菌粉是市场上最常见的双歧杆菌产品之一，此种产品主要是通过将双歧杆菌菌体进行干燥获得的。对于双歧杆菌菌粉来说，其含有的双歧杆菌活菌数是衡量其质量的重要标准之一。目前，主要通过平板活菌计数法检测双歧杆菌菌粉中的双歧杆菌活菌数。

但是，由于双歧杆菌对营养的要求非常苛刻，对氧非常的敏感，对低pH值的抵抗力差，并且，对渗透压的要求也非常高，因此，双歧杆菌在被梯度稀释的过程中会很容易死亡。而使用平板活菌计数法检测双歧杆菌菌粉中双歧杆菌活菌数时，对双歧杆菌菌粉进行梯度稀释的步骤必不可少，这无疑大大影响了使用此方法检测双歧杆菌菌粉中双歧杆菌活菌数时的可靠度和准确性，使得利用此方法检测得到的双歧杆菌菌粉中的双歧杆菌活菌数普遍偏低。

因此，急需找到一种可显著提高双歧杆菌在被梯度稀释时的存活率的梯度稀释液。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

(1)本发明提供了一种可显著提高双歧杆菌在被梯度稀释时的存活率的梯度稀释液，此梯度稀释液的成分包含L-半胱氨酸盐酸盐、吐温80、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和氯化钠；使用此梯度稀释液配合平板活菌计数法检测双歧杆菌菌粉中的双歧杆菌活菌数时，测得的活菌数高达2.0×1010CFU/g以上，而使用常规梯度稀释液(例如，生理盐水、缓冲液、无菌水和蛋白胨水等)配合平板活菌计数法检测双歧杆菌菌粉中的双歧杆菌活菌数时，测得的活菌数在2.0×1010CFU/g以下。

(2)本发明提供了一种可靠度和准确性高的对双歧杆菌进行计数的方法，此方法为先将含有双歧杆菌的待测样品用成分包含L-半胱氨酸盐酸盐、吐温80、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和氯化钠的梯度稀释液进行稀释，得到稀释液，再对稀释液进行活菌计数；利用此方法检测双歧杆菌菌粉中的双歧杆菌活菌数时，测得的活菌数高达2.0×1010CFU/g以上，利用常规方法(即使用常规梯度稀释液的方法)检测双歧杆菌菌粉中的双歧杆菌活菌数时，测得的活菌数在2.0×1010CFU/g以下。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。