本发明公开了一种基于DNA自组装结构对两种循环肿瘤DNA同时检测的方法,属于生物医学技术领域。本发明通过构建DNA六面体纳米结构基底,利用两种ctDNA存在时形成完整的六面体并形成具有催化活性的G 四链体 血红素复合结构,催化苯胺聚合反应,在六面体上形成聚苯胺,从而将靶标序列与DNA纳米结构的结合转化为电信号。并且由于碱基互补配对原则,当靶标序列发生突变时不会有电信号的产生,使该传感器特异性增强,能鉴别靶标序列突变,同时检测灵敏度提高。该方法相比于检测ctDNA的传统方法,检测时间短,特异性强,灵敏度高。

(1)将构建DNA六面体基底的四条核苷酸序列加入缓冲溶液中混匀，高温变性后复性，形成DNA六面体基底，将DNA六面体基底溶液滴加到电极上，孵育后得到吸附有DNA六面体基底的电极；

(2)将含有靶标Kras基因和Braf基因序列的溶液滴加至步骤(1)的吸附有DNA六面体基底的电极上，孵育后得到具有完整DNA六面体的电极；

(3)将含有辅助探针的溶液滴加至步骤(2)的具有完整DNA六面体的电极上，孵育得到连接有辅助探针的电极；

(4)将步骤(3)制备的电极浸泡在含有血红素的G-四链体形成液中，孵育形成连接有G-四联体-血红素复合体的电极；

(5)将步骤(4)制备的电极浸泡在苯胺沉积缓冲液中，催化苯胺反应形成聚苯胺吸附在DNA六面体上，得到吸附聚苯胺的电极；

(6)采用电化学工作站对步骤(5)得到的电极进行电流值测量；

(7)根据测定的电流值与靶标浓度之间的关系，绘制出相应的线性关系曲线；

(8)检测待测样品中靶标序列浓度时，按照(1)-(6)步骤，测量待测样品的电流值，将电流值代入步骤(7)的线性关系曲线中，计算待测样品中靶标序列的浓度。

卵巢癌是导致女性死亡人数最多的癌症之一，其具有致死率高、早期难以发现等特点。传统的癌症早期X光检测，超声波检测以及细胞学检测等，需要在肿瘤成型后才能观察到。循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是肿瘤细胞体细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统的核酸分子，是一种特征性的肿瘤生物标志物。对ctDNA进行检测是一种癌症早期检测的手段，可以在低浓度下在肿瘤早期进行诊断。在卵巢癌发生时，会伴有Kras基因第12个密码子的突变或者Braf基因V600E突变的发生，所以对这两种ctDNA进行突变的检测，可以在卵巢癌发生前期进行诊断。对ctDNA的检测方法包括聚合酶链式反应(PCR法)，实时多重PCR法，环介导的等温扩增等。然而，这些方法对操作者专业度要求高，成本高，准确度低，检测限高，并且需要对样品做预处理等，影响了检测的结果。

电化学生物传感器因其具备良好的选择性，高稳定性，高特异性，高灵敏度等优点而受到广泛的关注。电化学生物传感器包括分子识别部分和信号转换部分，分子识别部分识别靶标，而后将生物信号转换成电信号。目前，已经开发了许多基于电化学的ctDNA传感器，有酶联免疫法，小分子修饰法和生物酶法等，但目前还存在检测限高，特异性弱等问题。

DNA自组装是基于碱基互补配对原则，按照逻辑设计出特定构型，在合适的条件下形成预期结构的技术。目前已被广泛应用于药物靶向运输，小分子检测等领域。将DNA自组装技术与基于金电极的电化学检测结合起来，可以得到在低浓度下对靶标物质进行检测的功能性电化学生物传感器，降低传感器的检测限。但是目前还没有一种适用于同时检测两种循环肿瘤DNA的基于DNA自组装的电化学生物传感器。

江南大学是教育部直属、国家“211工程”重点建设高校和“双一流”建设高校。学校具有悠久的办学历史、厚重的文化积淀，源起1902年创建的三江师范学堂，历经国立中央大学、南京大学等发展时期；1958年南京工学院食品工业系整建制东迁无锡独立建校，成立无锡轻工业学院；1962年无锡纺织工学院并入无锡轻工业学院；1995年更名为无锡轻工大学；2001年无锡轻工大学、江南学院、无锡教育学院合并组建江南大学；2003年东华大学无锡校区并入江南大学。

本发明通过构建DNA六面体纳米结构基底，利用两种ctDNA存在时形成完整的六面体并形成具有催化活性的G-四链体-血红素复合结构，催化苯胺聚合反应，在六面体上形成聚苯胺，从而将靶标序列与DNA纳米结构的结合转化为电信号。并且由于碱基互补配对原则，当靶标序列发生突变时不会有电信号的产生，使该传感器特异性增强，能鉴别靶标序列突变，同时检测灵敏度提高。该方法相比于检测ctDNA的传统方法，检测时间短，特异性强，灵敏度高。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。