本发明公开了一种酸胁迫能力得到提高的大肠杆菌工程菌及应用,属于微生物工程技术领域。本发明以镍离子ABC转运蛋白周质结合蛋白NikA的基因为目的基因,以大肠杆菌为表达宿主,成功构建了一类可广泛应用于制备食品、药品、饲料以及化学品的大肠杆菌工程菌;该菌株酸胁迫能力得到了显著的提高,其对衣康酸的抗性是对照菌株的6.3倍;对D 乳酸的抗性是对照菌株的3.3倍;对琥珀酸的抗性是对照菌株的1.6倍。

本发明提供了一种抗酸胁迫能力提高的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌包含重组质粒与表达宿主；所述重组质粒为连接有目的基因的表达载体；所述目的基因为编码镍离子ABC转运蛋白周质结合蛋白NikA(Ni2+ABC transporterperiplasmic binding protein)的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述表达宿主为大肠杆菌***。

在本发明的一种实施方式中，所述镍离子ABC转运蛋白周质结合蛋白NikA来源于大肠杆菌***。

在本发明的一种实施方式中，所述镍离子ABC转运蛋白周质结合蛋白NikA的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述镍离子ABC转运蛋白周质结合蛋白NikA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pTrc99a。

本发明提供了一种提高大肠杆菌抗酸胁迫能力的方法，在大肠杆菌中过量表达镍离子ABC转运蛋白周质结合蛋白NikA。

在本发明的一种实施方式中，所述镍离子ABC转运蛋白周质结合蛋白NikA来源于大肠杆菌***。

在本发明的一种实施方式中，所述镍离子ABC转运蛋白周质结合蛋白NikA的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述镍离子ABC转运蛋白周质结合蛋白NikA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述过表达为先通过编码镍离子ABC转运蛋白周质结合蛋白NikA的基因与表达载体构建含有编码镍离子ABC转运蛋白周质结合蛋白NikA基因的重组质粒，再将重组质粒导入大肠杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述酸胁迫是衣康酸胁迫。

在本发明的一种实施方式中，所述酸胁迫是D-乳酸胁迫。

在本发明的一种实施方式中，所述酸胁迫是琥珀酸胁迫。

本发明还提供了上述抗酸胁迫能力提高的重组大肠杆菌在发酵生产代谢产物中的应用，所述代谢产物是参与有机酸代谢的物质。

大肠杆菌是原核生物中一种重要的宿主菌。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。它们不仅是研究生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上具有重要的学术价值，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。目前，已有多种高价值的有机酸生物发酵方法成功应用，其中也有人尝试以大肠杆菌为宿主来表达，但是常常存在酸胁迫的问题。

衣康酸学名为甲叉琥珀酸、亚甲基丁二酸，是不饱和二元有机酸，它含不饱和双键，具有活泼的化学性质，可进行自身间的聚合，也能与其他单体如丙烯腈等聚合，是化学合成工业的重要原料，也是化工生产的重要原料。采用大肠杆菌作为天然宿主时，由于大肠杆菌本身不具备衣康酸代谢能力，起初被报道出来的产量非常低，少于1g·L-1，后来发展到4.3g·L-1。直到最近，可见的报道中，衣康酸最高的产量也仅仅为47g·L-1，其合成途径主要由乌头酸氧化途径产生，从最终的产量上来，仍然与采用曲霉菌属为宿主时的产量有一定差距，其产率为0.86g·h-1·L-1，虽然与传统的曲霉类生产菌属相比，在产量上存在一些不足，但以大肠杆菌作为衣康酸的生产宿主依然可以被认为是具有潜力的。

江南大学是教育部直属、国家“211工程”重点建设高校和“双一流”建设高校。学校具有悠久的办学历史、厚重的文化积淀，源起1902年创建的三江师范学堂，历经国立中央大学、南京大学等发展时期；1958年南京工学院食品工业系整建制东迁无锡独立建校，成立无锡轻工业学院；1962年无锡纺织工学院并入无锡轻工业学院；1995年更名为无锡轻工大学；2001年无锡轻工大学、江南学院、无锡教育学院合并组建江南大学；2003年东华大学无锡校区并入江南大学。

(1)本发明在大肠杆菌中过量表达NikA蛋白显著提高了大肠杆菌的酸胁迫抗性，本发明的操作简单，可广泛的应用到工业生产中。

(2)本发明通过在大肠杆菌中过量表达NikA蛋白，得到了酸胁迫抗性显著提高的重组大肠杆菌Eschericha coli K12 MG1655/pTrc99a-NikA；该菌株对衣康酸的抗性是对照菌株的6.3倍；对D-乳酸的抗性是对照菌株的3.3倍；对琥珀酸的抗性是对照菌株的1.6倍。

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