本发明公开了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其构建方法,属于基因工程和酶工程领域。本发明将来源于Bacillus stearothermophilus NO2的环糊精葡萄糖基转移酶进行突变,得到了歧化水解比以及歧化反应催化效率提高的突变体;其中,突变体L277M/G282A的歧化活力与水解活力比值与野生型环糊精葡萄糖基转移酶歧化活力与水解活力的比值相比,提高了183.33%;突变体L277F、G282A、L277F/G282A的歧化反应催化效率与野生酶相比有所提高,分别是野生酶的1.128倍、1.186倍和1.253倍;采用本发明所构建的突变体能够降低生产成本,适于工业化生产。

为解决现有技术中存在的问题，本发明通过对来源于Bacillusstearothermophilus NO2的环糊精葡萄糖基转移酶进行改造，以获得歧化水解比或歧化反应催化效率提高的突变体，将突变体应用于工业生产。

本发明提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第277位氨基酸进行突变得到的；

或者，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第282位氨基酸进行突变得到的；

或者，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第277位氨基酸和第282位氨基酸同时进行突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为以下(a)～(d)任一：

(a)将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第277位的由亮氨酸突变为苯丙氨酸，并命名为L277F，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(b)将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第282位的由甘氨酸突变为丙氨酸，并命名为G282A，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(c)将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第277位和第282位由亮氨酸和甘氨酸分别突变为甲硫氨酸和丙氨酸，并命名为L277M/G282A，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(d)将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第277位和第282位由亮氨酸和甘氨酸分别突变为苯丙氨酸和丙氨酸，并命名为L277F/G282A，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶来源于Bacillusstearothermophilus NO2，编码所述环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

本发明还提供了一种编码上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因。

环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase，EC #)属于α-淀粉酶家族(糖苷水解酶13_2，GH13_2)，能够以淀粉、麦芽糊精等为底物催化转糖苷反应以及水解反应。其中，转糖苷反应包括歧化反应、环化反应及偶合反应。歧化反应是两个不同分子间发生的转糖苷反应，环化反应是分子内发生的转糖苷反应，偶合反应是环化反应的逆反应。在实际应用中，常利用CGTase歧化反应生成多种水溶性、稳定性提高的糖苷化合物，如L-抗坏血酸、橙皮苷、柚皮苷的糖基化产物。然而，已发现的所有天然来源的CGTase均同时具有歧化和水解活性，水解反应作为副反应会降低转糖苷产物的产量；因此，在工业生产中CGTase的水解活性应该尽可能的降低。

目前，CGTase很难进一步提高其歧化反应效率，大多数的突变体不能同时兼顾提高歧化活力和降低水解活力，歧化水解比或歧化反应效率的提高可以有效的提高产量，是工业生产中需要解决的一大难题。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

本发明所得到的突变体L277F、G282A、L277M/G282A和L277F/G282A具有如下效果：

(1)采用本发明的方法，得到了歧化活力与水解活力比值得到提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，突变体L277F和L277M/G282A的歧化活力与水解活力比值与野生型环糊精葡萄糖基转移酶歧化活力与水解活力的比值相比，分别提高了32.04％和183.33％。

(2)采用本发明的方法，环糊精葡萄糖基转移酶在歧化反应中催化效率得到了提高，突变体L277F、G282A和L277F/G282A的kcat/Km分别为773.82s-1mM-1、813.53s-1mM-1和859.97s-1mM-1，与野生酶kcat/Km为686.07s-1mM-1相比，分别是野生酶的1.13倍、1.19倍和1.25倍。

科技成果只有通过实施开发应用，使其转化为生产力，才能取得经济效益和社会效益。成果方目标是将科技成果转化为现实生产力，期待有意愿的企业或合作单位进行合作推广或者进行产品生产。考虑合作转化、许可+合作等转化方式与企业、科学技术研究开发机构和其他组织建立合作关系。