本发明公开了一种突变型丙酮酸氧化酶及其在2 丁酮酸代谢解毒中的应用,具体涉及一种利用该突变型丙酮酸氧化酶重构乙酸旁路途径增强细胞对2 丁酮酸耐受性的方法,属于基因工程和微生物发酵技术领域。对丙酮酸氧化酶(PoxB)进行定点饱和突变得到PoxBF112W突变体,该酶增强了丙酮酸选择性,减弱了2 丁酮酸结合亲和力。基于此突变体,在微生物细胞TWF115 ΔaceE中重建乙酸旁路,用于L 苏氨酸的生物合成供应乙酰辅酶A和还原型辅助因子。该重构的乙酸旁路途径可以进一步去除2 丁酮酸的代谢毒性,帮助宿主菌TWF115 ΔaceE在5g/L的2 OBA添加下合成更高的L 苏氨酸(13.98g/L)。

本发明涉及一种突变型丙酮酸氧化酶及其在2-丁酮酸代谢解毒中的应用，具体涉及一种利用该突变型丙酮酸氧化酶重构乙酸旁路途径增强细胞对2-丁酮酸耐受性的方法，属于基因工程和微生物发酵技术领域。

本申请采用了构建乙酸旁路来降低2-丁酮酸对丙酮酸参与TCA途径的抑制作用，提高乙酸辅酶A的生成和L-苏氨酸的合成，提供了一种突变型丙酮酸氧化酶及其在2-丁酮酸代谢解毒中的应用。

本发明的第一个目的是提供一种丙酮酸氧化酶PoxBF112W突变体，所述突变体含有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供编码所述丙酮酸氧化酶PoxBF112W突变体的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.7。

本发明的第三个目的是提供一种重组大肠杆菌。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌表达所述突变型丙酮酸氧化酶PoxBF112W。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是以敲除了丙酮酸酯甲酸酯裂解酶(tdcE)和丙酮酸脱氢酶E1组件(aceE)基因的大肠杆菌TWF105为宿主。

在一种实施方式中，所述丙酮酸酯甲酸酯裂解酶(tdcE)核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

在一种实施方式中，所述丙酮酸脱氢酶E1组件(aceE)核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌还表达乙酰辅酶A合成酶(ACS)。

在一种实施方式中，所述乙酰辅酶A合成酶来源于大肠杆菌(GeneID:948572)。

在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是以pFT26为表达载体。

在一种实施方式中，所述表达载体pFT26是在质粒pFT24质粒基础上过表达一个热敏回路cIts-PRL，敲除TetR阻遏蛋白和PLtetO-1启动子获得的。

本发明第四个目的是提供所述突变型丙酮酸氧化酶PoxBF112W在L-苏氨酸合成中的应用。

本发明第五个目的是提供所述重组大肠杆菌在L-苏氨酸合成中的应用。

微生物细胞在其生活和生产过程中经常遭受细胞内有毒代谢产物和不利的环境因素的侵害，例如乙二醛，甲基乙二醛，松柏醛，糠醛等。2-丁酮酸(2-OBA)，也称为2-酮丁酸或α-酮丁酸，属于α-酮酸类的短链酮酸，结构接近丙酮酸。2-OBA是生物代谢必不可少的中间体，从细菌到人类的所有生物物种中都存在。然而，2-OBA在大多数微生物中的积累会导致严重的细胞毒性，包括生长停滞甚至死亡。在L-异亮氨酸，L-2-氨基丁酸，1-丙醇和1-丁醇等这些2-OBA衍生物的生物合成过程中，苏氨酸脱氨酶催化L-苏氨酸分解生成2-OBA，为了避免2-OBA的毒性积累，苏氨酸脱氨酶表达水平往往受到限制，这限制了下游生物合成代谢流量和目标产物生产率的提高。这种类型的生物毒性不仅阻碍发酵菌株的生长，而且阻碍了目标产物的生物合成。迄今为止，还没有系统地阐明2-OBA在微生物中的毒性机理，也没有发现更有效的解决方案来减轻其对微生物细胞的代谢毒性。

在大多数微生物中，乙酰辅酶A(ACS)的供应主要依赖于高酶活性的PDHc将丙酮酸转化为乙酰辅酶A。利用乙酸与PDHc协同作用是增加乙酰辅酶A合成量的一种有效方法。此外，还有另一种方法，通过结合PoxB和乙酰辅酶A合成酶来催化丙酮酸生成乙酰辅酶A，也称为乙酸旁路途径，在大肠杆菌中已被用来提供乙酰辅酶A来生产异丙醇。来源大肠杆菌的PoxB是硫胺素和黄素依赖性外周膜酶，可催化丙酮酸氧化脱羧成乙酸盐和CO2。与丙酮酸相似，2-OBA也能作为PoxB的底物，并被转化为丙酸和CO2(图1)。现有报道中常通过消耗2-OBA来减轻其代谢累积对丙酮酸和乙酰辅酶A的影响，但这些方法使得L-苏氨酸产量的提高仍然无法满足工业上生产的需求。因此，提供一种新的提高L-苏氨酸合成的方法，对于进一步提高苏氨酸的合成具有十分重大的意义。

江南大学（Jiangnan University），坐落于无锡市，是中华人民共和国教育部直属高校，国家“双一流”建设高校， “211工程”、“985工程优势学科创新平台”重点建设高校，入选国家“111计划”、卓越农林人才教育培养计划、卓越工程师教育培养计划、国家建设高水平大学公派研究生项目、国家大学生创新性实验计划、国家级大学生创新创业训练计划、国家级新工科研究与实践项目，是高水平行业特色大学优质资源共享联盟成员、“一带一路”高校食品教育科技联盟成员、中国政府奖学金来华留学生接收院校、国家大学生文化素质教育基地、首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。

(1)本发明开发了检测2-丁酮酸代谢毒性的方法，应用一株大肠杆菌TWF105的L-苏氨酸合成能力来评估2-丁酮酸的代谢毒性。该菌株的L-苏氨酸的合成途径和吡啶核苷酸转氢酶表达水平均被增强，其基因组上的poxB、pflB、ldhA和adhE基因都被敲除。在发酵初期保持足够的生物量积累，将添加外源2-丁酮酸的时间点设置为发酵开始后的6h。添加2-丁酮酸后L-苏氨酸增加量根据2-丁酮酸添加量的不同发生显著变化。随着2-丁酮酸添加量增加，L-苏氨酸增加量明显减少，L-苏氨酸的生物合成抑制率明显增加，在发酵反应体系中2-丁酮酸添加量为5g/L时达到其最大值88.79％。

(2)本发明中乙酸旁路途径被构建在温度控制表达载体pFT26并进行诱导表达。通过2-丁酮酸毒性检测实验，乙酸旁路途径代替大肠杆菌中的丙酮酸脱氢酶复合物(PDHc)，可以减轻2-丁酮酸对细胞的代谢毒性。其中，来源于大肠杆菌的野生型ACS和来源大肠杆菌的PoxB组合TFW115ΔaceE/pFT26a1B2表达表现出最好的解毒效果。

(3)本发明中突变型丙酮酸氧化酶(PoxB)通过定点饱和突变和底物偏好筛选获得，其对丙酮酸底物偏好性更高。该突变体PoxBF112W表现出20倍的丙酮酸/2-丁酮酸的活性比，并失去了大部分对2-丁酮酸底物的活性，其活性比相比野生型提高提高了3.2倍。

(4)本发明中突变型丙酮酸氧化酶PoxBF112W被用来重构乙酸旁路途径，代替苏氨酸生产菌的PDHc，为细胞提供乙酰辅酶A来产生还原型辅因子NADPH和ATP，促进菌株合成L-苏氨酸。该重构的乙酸旁路途径可以进一步去除2-丁酮酸的代谢毒性，帮助宿主菌TWF115ΔaceE在5g/L的2-丁酮酸添加下合成更高的L-苏氨酸(13.98g/L)。

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