科创中国

生物与新医药技术

一种能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株及其构建方法、蛋白表达纯化方法和蛋白应用，它涉及一种重组菌株的构建、表达纯化及其应用。本发明要解决现有金针菇免疫调节蛋白工程菌株表达率低，表达产物多为不溶性的包涵体，结构不确定以及菌体破碎、纯化工艺复杂不适合大规模生产应用的问题。本发明将金针菇免疫调节蛋白基因，以Transetta(DE3)作为宿主菌，构建重组菌株；再用IPTG诱导表达，通过溶菌酶法结合超声法处理后采用Ni-His·Band柱层析，Sephadex G25凝胶层析柱方法脱盐，即完成重组菌株的构建及表达纯化。其用于制备预防或治疗过敏症的药物。其纯化过程简单而快速，适于规模化发酵生产。

与在其它大肠杆菌中表达的可溶性产物少（产量为5mg/L，KO JL et al.,1997）或大多为不溶性的包涵体，需要进行变性复性过程（“孔祥辉等，2007”）相比，本发明的重组菌株选定为具有氯霉素抗性基因、含有6种稀有真核基因密码子（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA）对应的tRNA的高表达基因工程菌株Transetta(DE3)。 本发明的可溶性重组蛋白表达率为菌体总蛋白的40%以上，比以往的表达率仅为22%左右（张介驰等，2007）提高80%以上，产量为45mg/L以上，比2009年徐贵雪等用pET-28构建的表达载体生产的重组蛋白产量(30mg/L)提高了50%以上。本发明使用溶菌酶（作用浓度0.1mg/mL）结合超声波法（作用时间20min）使菌体破碎率达到98%以上，比单用溶菌酶（作用浓度0.1mg/mL，破碎率28%）和单用超声波法（作用时间20min，破碎率40%）提高30%以上，并节约了成本；经圆二色谱测定表达蛋白二级结构，含15%的α-螺旋和38%的β折叠，比例接近天然蛋白，这是本发明的蛋白具有更好生物活性的结构基础，更具有开发应用价值。

黑龙江省科学院微生物研究所始建于1959年9月9日，原名中国科学院林业土壤研究所生物分所，隶属于中国科学院东北分院，1971年1月下放到黑龙江省，1973年后隶属黑龙江省科学院。黑龙江省科学院微生物研究所是从事生物工程技术、微生物等方面的基础性研究与科技开发的综合性科研机构。在基因工程技术、生物质能源、食用菌菌种保藏与应用、废水微生物处理、生物肥料、生物农药、微生物保健品、固液综合配套发酵技术等领域形成了专业特色和技术优势。长期承担国家五年计划项目、"863" 计划项目、国家自然基金项目和各部委、省市科研项目，已取得400余项科技成果，其中国家、部委项目45项及省重点项目57项，成果达国际先进水平以上30余项。获国家科技进步奖6项、省部级科技进步奖37项，发表一级以上学术论文800余篇，申请专利60余项，出版专著10余部。其中“灵杆菌素”、“金葡菌素”、“复合氨基酸”、“微生物肥料系列产品”、“微生物农药系列产品”、“光合细菌系列产品”、“食用菌系列产品”等科研成果在生产中应用，取得了可观的经济效益和巨大的社会效益。