本发明公开了一种热凝胶固定化壳聚糖酶填充床反应器及其应用,属于生物工程领域。本发明将可特异性结合热凝胶多糖的CBM结构域与壳聚糖酶在毕赤酵母中融合表达,并基于CBM的靶向性、选择性和高特异性结合热凝胶的机理,实现原位、一步纯化固定化地快速制备热凝胶固定化Csn75 CBM填充床反应器;再通过分批补料Csn75 CBM,实现真正连续生产壳寡糖的目的,还通过控制填充床酶量、底物浓度及底物流速实现不同聚合度壳寡糖的制备。本发明原位制备固定化酶填充床的方法使得生产成本大幅降低,无需反复拆卸安装,因而也节约了拆装时间,提高了生产效率。