本发明公开了一种测定水解酶活性的方法。所述方法通过将含有底物、Fe3+和红菲绕啉二磺酸钠的检测液与待测水解酶溶液孵育,底物与水解酶反应生成还原性产物,还原性产物将Fe3+还原成Fe2+,Fe2+与红菲绕啉二磺酸钠结合形成Fe2+?红菲绕啉复合物,检测液由无色变为深红色,且在535nm处有很强的吸收峰。样品中水解酶活性越高,检测液颜色越深。本发明方法对水解酶活性的检测灵敏度高,选择性好,抗干扰能力强,可重现性好,操作简便,检测时间短,可用于临床样品中水解酶活性的快速、高灵敏检测,极大地降低了检测成本。