本发明公开了一种分离制备高纯度甘草次苷的方法。用国产非极性大孔吸附树脂装填交换柱。以离心或过滤后的甘草酸的生物转化溶液为上样的粗品溶液,使其通过交换柱,动态吸附至贯穿点。酸性水溶液冲洗后,低浓度的有机溶剂或pH值较低的碱性溶液作为洗脱液对交换柱进行动态的洗杂,后用高浓度的有机溶剂或pH值较高的碱性溶液作为洗脱液对交换柱进行动态的洗脱,收集该洗脱过程中的洗脱液,经干燥后,得到纯度大于80%的甘草次苷固体粉末。本发明公开的分离纯化方法具有工艺操作简单,分离效果好,成本消耗低,易进行工业化生产的特点。