荧光定量PCR检测醋醅中巴斯德醋酸杆菌的方法

1.一种应用荧光定量PCR检测醋醅中巴斯德醋酸杆菌的方法，其特征及具体步骤如下： ①设计、合成针对巴斯德醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus）的特异性引物； ②对分离纯化得到的巴斯德醋酸杆菌进行摇瓶培养，利用细菌提取试剂盒对其培养液进行DNA提取； ③以巴斯德醋酸杆菌的DNA为模板，以Ap-F/Ap-R为引物进行PCR扩增，获得目的片段，并将PCR产物割胶回收； ④构建重组质粒，将目的片段与pMD19-T Vector 连接，连接后转化JM109大肠杆菌感受态细胞，挑取转化子扩大培养，提取质粒，并用PCR验证目的片段是否插入pMD19-T Vector，验证成功的质粒作为荧光定量PCR的标准样品； ⑤利用液氮研磨、酶消化和高盐提取结合的方法提取发酵过程中不同时间点醋醅群落的总DNA作为待测样品； ⑥确立荧光定量PCR反应体系和反应条件； ⑦重组质粒倍比稀释8个梯度，与待测样品同时进行荧光定量PCR，根据标准样品的拷贝数与CT值建立标准曲线，然后通过标准曲线和待测样品的CT值对醋酸发酵过程不同时间醋醅群落中巴斯德醋酸杆菌进行定量分析。
2.如权利要求1所述的方法，其特征为，步骤①中针对巴斯德醋酸杆菌的特异性引物序列（5′→3′）为： Ap-F：TCAAGTCCTCATGGCCCTTATG Ap-R：TCGAGTTGCAGAGTGCAATCC。
3.如权利要求1所述的方法，其特征为，步骤⑤所述的利用液氮研磨、酶消化和高盐提取结合的方法提取发酵过程中不同时间点醋醅群落的总DNA作为待测样品的方法具体操作为：称取2 g 醋醅，在研钵中加入液氮充分研磨，转移至50 mL 离心管；向离心管中加入6 mL DNA 抽提缓冲液，再加入100 μL 溶菌酶（50 mg/mL），于225 rpm摇床上37℃摇动30 min；向离心管中加入 *** mL 10% SDS，65℃水浴2 h，每隔 15～20 min 轻轻颠倒几下，室温 6000×g 离心10 min；收集上清；将上清液用等体积的氯仿-异戊醇（24:1体积比），抽提一次，以***倍体积的异丙醇室温沉淀1h, 16000g 离心20 min, 收集核酸沉淀，用70%乙醇洗涤沉淀，DNA沉淀干燥后溶于100 μL TE或ddH2O中，加入终浓度为*** μg/ml RNaseA, 并在37℃下水浴消化2 h,以去除RNA, 用***%琼脂糖凝胶电泳验证DNA提取的效果，如果在10 kb左右出现条带，则DNA提取成功，将成功提取的DNA溶液置于-20℃冰箱保存备用。
4.如权利要求1所述的方法，其特征为，步骤⑥确立的荧光定量PCR反应体系和反应条件如下：反应体系采用20μL体系，其中SsoFast EvaGreen 预混液10 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，模板DNA10 ng，ddH2O加至20 μL；反应条件为95℃预变性 30 s；95℃变性5 s，57℃退火10 s，读取荧光信号数据，共循环扩增40次。

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