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一种基于PCR组装磁性纳米粒子进行DNA检测的方法
发布时间: 2022-05-16
基本信息
合作方式：
技术转让
成果类型：
发明专利
行业领域：
其他
成果介绍
- 1.一种基于PCR组装磁性纳米粒子进行DNA检测的方法，其特征在于包括：磁性纳米粒子分别与上游引物及下游引物偶联，磁性纳米粒子应用PCR进行组装，磁性纳米粒子组装体应用磁共振信号进行检测；具体步骤为： （1）磁性纳米粒子分别与上游引物、下游引物偶联 *** mg mL-1的磁性纳米粒子用含137 mM NaCl的*** PBS稀释20倍，在1mL稀释好的磁性纳米粒子中，加入*** mg 碳二亚胺EDC和*** mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺NHS，活化反应15min；活化后的磁性纳米粒子分别加入上游引物、下游引物进行偶联，引物的终浓度均为4μM，室温振荡反应6h；反应物用截留分子量为3000的超滤管进行超滤，除去未偶联的引物，此步骤超滤三次，以保证引物被完全除去；最后截留物用超纯水进行重悬，以得到偶联好的引物修饰的磁性纳米粒子； 上游引物：5’-GAAGGACGAAGGACTCTAACG- NH2-3’， 下游引物：5’-CAATGGCAAAGGATGTTAAACG- NH2-3’； （2）磁性纳米粒子应用PCR进行组装 整个PCR反应在50μL的反应体系中进行，其中包含：1×PCR buffer，400μM dNTP，*** Taq DNA聚合酶，上、下游引物分别修饰的磁性纳米粒子各***μL，目标DNA 1μL，所用的目标DNA的浓度为10倍梯度稀释，分别为10000 fM、1000 fM、100 fM、10 fM、1 fM、*** fM、*** fM；PCR反应参数为：首先94℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，总共为30个循环；目标DNA： 5’-GAAGGACGAAGGACTCTAACGTTTAACATCCTTTGCCATTG-3’； （3）磁性纳米粒子组装体应用磁共振信号进行检测 将步骤（2）目标DNA不同浓度下得到的磁纳米粒子聚集体加入到微孔板中，应用磁共振信号进行检测，首先测定样品的横向弛豫时间T2，得到横向弛豫时间与目标DNA浓度之间的关系，绘制标准曲线；所用的仪器为上海纽迈电子科技公司核磁共振成像设备Niumag-NMI20-Analyst，扫描时间参数为：场强为***，中心频率为***，脉冲重复间隔时间TR为3000ms，回波时间TE为200μs，共8个回波； 再测定样品的核磁共振成像T2加权像，所用的仪器为上海纽迈电子科技公司核磁共振成像设备MiniMR-60，成像参数为：场强为***，中心频率为***，脉冲重复间隔时间TR为1000ms，回波时间TE为100ms，共8个回波； 通过磁共振信号对磁性纳米粒子组装体进行检测，从而间接检测目标DNA含量。
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