本发明属于生物工程技术领域,涉及一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法。本发明的产丁二酸基因工程菌菌株分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)BA305,其保藏号编号为CCTCCNO:M2012102。其构建过程主要包括失活或敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和磷酸转运系统中的ptsG基因,并过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶,使重组大肠杆菌能够高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖及果糖等单糖,同时高效利用各种比例混合糖以及纤维素水解液生长,大幅度提高了丁二酸的合成效率。其发酵方法采用两阶段发酵方式,有氧阶段提高生物量,厌氧阶段发酵产酸。