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一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素D的双抗体夹心法
发布时间: 2022-05-12
基本信息
合作方式：
技术转让
成果类型：
发明专利
行业领域：
其他
成果介绍
- 1.一种检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素D的双抗体夹心法，金黄色葡萄球菌肠毒素D缩写为SED，其特征在于：酶标板上包被了捕获抗体5F2，即CGMCC ***，合适的浓度下可以最大限度捕获SED；洗板3次，洗去未结合的抗体，加入封闭液200μL封闭板孔上多余结合位点；洗板3次，加入样品及对照，37℃孵育1h；洗板3次，加入酶标抗体10F1-HRP，即CGMCC ***，37℃孵育1h；洗板4次，加入显色液显色15min； 样品中SED浓度≥***，那么样品中SED被包被抗体捕获并与酶标抗体10F1-HRP结合，并催化底物在450nm产生吸收值，并被判定为阳性； 样品中SED浓度＜***，那么样品中SED不被捕获或者捕获数量太小不足以引起足够的信号，被判定为阴性； （1）SED单克隆抗体的制备 以北京军事医学科学院提供的重组表达的SED为免疫原，免疫 8周龄的BALB/c小鼠，经免疫、细胞融合、筛选，共筛选到10个细胞株； （2）单克隆抗体的配对筛选 将纯化后的10株单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对，配对参数如下：包被抗体5μg/mL；包被液为***、***的碳酸盐缓冲液；标品浓度30ng/mL标品稀释液***、*** 的PBS；酶标抗体稀释800倍使用；在此条件下，实验成功得到了11对P/N值>10的配对； （3）夹心法的建立 选择检测限最稳定的配对，即以5F2为包被抗体，以10F1作为酶标抗体建立夹心法；具体参数如下： 抗体包被浓度：1μg/mL， 包被液：***、***碳酸盐缓冲液， 标品稀释液：***、*** 的PBS， 酶标抗体浓度：1μg/mL， 反应时间：包被：4℃过夜，封闭37℃，2h；标准品，37℃，1h；酶标抗体37℃，1h；显色15min； 优化后SED夹心法，LOD：***，检测限***。
- 2.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌肠毒素D的双抗体夹心法，其特征在于：测定步骤为： a、包被:用1μg/mL的5F2包被酶标板，100μL /孔，4℃过夜； b、洗涤:用PBST洗涤反应板三次，每次3min，200μL /孔，然后甩干反应板，所述PBST为含***%吐温-20的PBS； c、封闭:含***%明胶的CBS，200μL /孔，37℃封闭2h； d、洗涤:同b； e、样品:用PBS将SED母液稀释成***，***，***，***，***，***，***，***系列浓度，另设一个PBS空白对照，每孔加入100μL样品，于37℃温育1h； f、洗涤：同b； g、加1μg/mL的酶标抗体10F1-HRP，100μL /孔，37℃反应1h； h、洗涤：同b； i、显色：加底物TMB 100μL /孔，显色15min； 显色液应在使用前，按照显色液A:显色液B体积比=5:1的比例配置使用； 显色液A：*** g柠檬酸，*** g Na2HPO4·12H2O，18 μL 30%H2O2，100mL水； 显色液B：60 mg四甲基联苯胺TMB溶于100 mL乙二醇； j、终止：加2 mol/L硫酸终止液50μL /孔； k、测定：用酶标仪检测OD450nm，绘制SED双抗体夹心法的标准曲线，样品测定时从该标准曲线上OD450nm值对应求得样品中SED含量。
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