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一株异源表达MpFADS6基因的重组高山被孢霉菌株、其构建方法及其在生产EPA中的应用

发布时间: 2022-05-12

基本信息

合作方式： 技术转让
成果类型： 发明专利
行业领域：
其他
成果介绍
  • 1.异源表达MpFADS6基因的重组高山被孢霉在生产EPA中的应用，包括： 1)摇瓶种子培养：取500μL浓度为107个/mL的重组高山被孢霉菌株的孢子液，接种于含种子培养基50mL的250mL锥形瓶中，28℃200r/min摇床培养36h，将湿菌体称重，加入4倍重量的种子培养基用分散器打散，作为发酵用菌种；所述异源表达MpFADS6基因的重组高山被孢霉是高山被孢霉(Mortierella alpina)MpFADS6，该菌株于2015年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC ***； 所述种子培养基组成为：20g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，1g/L KH2PO4，***·7H2O，10g/L KNO3，pH ***； 发酵培养基成分：葡萄糖50g/L，1vol‰牡丹籽油(PSO)和***％Tween 80或50g/L牡丹籽粕汁(PSM)，***，KH2PO43g/L，Na2SO41g/L，MgCl2·6H2O ***，CaCl2·***，pH ***，115℃灭菌20min； 所述牡丹籽粕汁由以下方法得到：取200g牡丹籽粕，粉碎过筛后置于4L水中煮沸，沉淀，用4层纱布过滤，得到牡丹籽粕； 2)摇瓶发酵培养：发酵用菌种按1wt％的接种量接种到含发酵培养基50mL的250mL锥形瓶中，28℃200rpm/min摇床培养7天，或28℃200rpm/min培养3天再12℃培养8天； 3)收集菌体并提取脂肪酸。
  • 2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述MpFADS6基因来自细小微胞藻CCMP1545。
  • 3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述重组高山被孢霉的构建方法包括以下步骤： a)以含有MpFADS6基因的质粒PUC-MpFADS6为模板，利用PCR扩增获取MpFADS6基因； b)构建重组质粒pBIG2-ura5s-MpFADS6； c)用重组质粒pBIG2-ura5s-MpFADS6转化根癌农杆菌，得到含重组质粒pBIG2-ura5s-MpFADS6的根癌农杆菌； d)用经过转化的根癌农杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株； e)筛选鉴定转化菌株，获得异源表达MpFADS6的重组高山被孢霉。
  • 4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤a)中扩增MpFADS6基因的引物序列如下： P1(sense)：5’-TACCGGAATTCATGTGCCCGCCGAAGACGGACGGC-3’ P2(antisense)：5’-TCTAGCCCGGGTCAGTGCGCCTTCTCCGCCTTGCC-3’。
  • 5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤b)中，利用高山被孢霉基因操作通用载体pBIG2-ura5s-ITs构建重组质粒pBIG2-ura5s-MpFADS6。
  • 6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤c)中所使用的根癌农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1。
  • 7.根据权利要求3所述的应用，其特征在步骤d)的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株是高山被孢霉尿MAU1，该菌株于2013年11月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC ***。
  • 8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤e)中筛选鉴定转化菌株的方法包括以下步骤： 1)取5mL无菌生理盐水冲刷GY平皿表面，收集孢子液，过25μm滤膜； 2)稀释获得三个浓度梯度108/L、107/L、106/L的孢子液，分别取150μL涂布于含有100μg/mL壮观霉素和100μg/mL头孢噻肟的GY-CS平板上，25℃培养2-3天； 3)用无菌镊子挑出生长的真菌菌丝于含有100μg/mL壮观霉素和100μg/mL头孢噻肟的SC-CS平板上，25℃培养2-3天； 4)观察高山被孢霉平板上的生长情况，挑出在所述SC-CS平板上生长的菌丝接种于GY斜面上； 5)将上述步骤4)中GY斜面上的高山被孢霉菌株孢子在GY斜面上传代三次； 6)将稳定遗传的菌株鉴定为异源表达MpFADS6基因的重组高山被孢霉菌株，保藏于GY斜面上； 7)提取含有MpFADS6基因的重组高山被孢霉菌株的基因组DNA，设计一对与启动子和终止子特异性结合的引物进行PCR验证： P3(sense)：CACACACAAACCTCTCTGTGAGGAC P4(antisense)：CAAATGAACGTATCTTATCGTGGAGG； 8)所述重组菌株保藏于GY斜面上。
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