技术领域

本发明涉及一种嘌呤核苷磷酸化酶的制备方法及应用，属于基因工程与啤酒发酵领域。

背景技术

嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)是一类催化嘌呤核苷及其2'-脱氧嘌呤核苷可逆磷酸化的酶，属于N-水解和转移酶家族，其广泛分布于各种生物细胞中。根据来源、亚基组成、分子量和底物特异性等差异可将其主要分为两大类：第一类为高分子量同源六聚体，分子量约为110-160kDa，其底物特异性较广，能催化6-氨基嘌呤和6-氧嘌呤及其核苷，大肠杆菌、克雷伯氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等来源的PNPase为该类酶的典型代表。第二类为低分子量同源三聚体，分子量约为80-100kDa，以6-氧嘌呤及其核苷为底物，通常被称为“肌苷-鸟苷磷酸化酶”，这类酶多见于一些细菌和哺乳动物中。以外，其他来源的PNPase由于底物特异性、分子量与上述两类标准差异较大，统称为其他类。

啤酒中含有大量的嘌呤类物质(purines)，其含量一般为40mg/L-100mg/L，这些嘌呤类物质主要是游离态的嘌呤碱基、结合态的嘌呤核苷和嘌呤核苷酸，酵母能且只能利用游离态的嘌呤碱基。通过对市售啤酒的大量检测，结果表明啤酒中主体嘌呤物质为嘌呤核苷，嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)能够将麦汁中的嘌呤核苷分解为游离嘌呤碱基，在发酵过程中，更多的游离嘌呤碱基被酵母所利用，最终降低啤酒中的嘌呤含量。

嘌呤核苷磷酸化酶在野生菌株中含量较少，通过筛选来获得高酶活菌株这一方法比较困难，因此我们尝试利用基因工程的技术手段来克隆目的基因，以期在宿主菌中可以得到高水平表达。本发明选取大肠杆菌的PNPase作为表达对象，制得的嘌呤核苷磷酸化酶，酶活力高，能够将麦汁中的嘌呤核苷水解成游离嘌呤碱基。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种嘌呤核苷磷酸化酶的制备方法，用于催化嘌呤核苷水解解生成游离嘌呤碱基。

所述嘌呤核苷磷酸化酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)将核苷酸序列如SEQ ID ***所示的基因，以pET28a(+)为表达载体，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，构建重组菌；

(2)发酵培养重组菌制备嘌呤核苷磷酸化酶。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养是将重组菌种子液转接到LB/Kanr液体培养基中，37℃培养至对数生长期中期，加入异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度***，30℃诱导培养4-5h。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养是将重组菌种子液，按1％接种量转接到LB/Kanr液体培养基中，37℃培养至发酵液OD600＝***，加入异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为***，30℃诱导4h。

本发明还提供一种重组表达嘌呤核苷磷酸化酶的大肠杆菌工程菌，是将核苷酸序列如SEQ ID ***所示的基因，以pET28a(+)为表达载体，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主构建得到的。

本发明制备得到的嘌呤核苷磷酸化酶可用于催化麦汁中的嘌呤核苷磷酸解生成游离嘌呤碱基，在啤酒发酵过程中，游离嘌呤碱基被酵母利用，为低嘌呤啤酒的生产提供依据。

本发明构建得到的重组表达嘌呤核苷磷酸化酶的大肠杆菌工程菌，经发酵培养，嘌呤核苷磷酸化酶的酶活力达到***，远远高于现有水平。本发明为嘌呤核苷磷酸化酶在麦汁糖化工艺中的应用提供重要基础。

附图说明

图1为pMD18-T载体的结构示意图。

图2为pET28a(+)质粒连接模式示意图。

图3为PCR扩增得到PNPase基因目的条带图；M为Marker；1、2均为PCR扩增产物；3为阴性对照；4为阳性对照。