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一种毕赤酵母中共表达血红蛋白VHb和纤维素酶蛋白的构建方法
发布时间: 2022-05-12
基本信息
合作方式：
技术转让
成果类型：
发明专利
行业领域：
其他
成果介绍
- 1.一种毕赤酵母中共表达血红蛋白VHb和纤维素酶蛋白的构建方法，其特征在于如下步骤： 1)密码子偏向性优化：本发明利用软件GeneDesigner实现对***所示的EGII核苷酸序列密码子偏向性优化，优化后核苷酸序列如***所示。 2)pPIC9K-eg2表达载体构建：以质粒pPIC9K为载体，将优化后的EGII基因插入启动子AOX1下游，5’端酶切位点为EcoRI，3’端酶切位点为NotI，构建pPIC9K-eg2表达载体。 3)获取重组菌株：以SacI作为pPIC9K-eg2表达载体线性化位点，实现表达载体线性化，通过电转化转入毕赤酵母。 4)获得vgb基因：从NCBI中获取透明颤菌血红蛋白基因，在5’端添加EcoRI酶切位点，3’端添加NotI酶切位点，通过人工合成获得目的基因。 5)pPICZαA-vgb表达载体构建：以质粒pPICZαA作为载体，将vgb基因插入启动子AOX1下游，5’端酶切位点为EcoRI，3’端酶切位点为NotI，构建pPICZαA-vgb表达载体。 6)通过高浓度遗传霉素G-418与博来霉素双抗性筛选得到高拷贝共表达菌株。 7)比较EGII重组菌株与EGII和VHb共表达菌株的产酶水平。
- 2.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中共表达血红蛋白VHb和纤维素酶蛋白的构建方法，其步骤1)密码子偏向性优化，密码子主要是指编码内切纤维素酶、外切纤维素酶、β-葡萄和糖苷酶，以及木聚糖酶和木糖苷酶，另外也涉及半纤维素侧链水解相关的酶类。
- 3.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中共表达血红蛋白VHb和纤维素酶蛋白的构建方法，其描述的共表达重组菌株，是指重组毕赤酵母菌。
- 4.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中共表达血红蛋白VHb和纤维素酶蛋白的构建方法，其重组菌株能够稳定高效表达纤维素酶蛋白，且共表达毕赤酵母菌株在纤维素酶蛋白的同时能够产有活性的VHb蛋白。
- 5.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中共表达血红蛋白VHb和纤维素酶蛋白的构建方法，其步骤1)的EGII是由如***或***所示核苷酸序列所编码的里氏木霉葡聚糖外切酶II基因。
- 6.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中共表达血红蛋白VHb和纤维素酶蛋白的构建方法，其步骤1)中描述的EGII基因密码子偏向性优化，优化后EGII核苷酸序列如***所示。
- 7.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中共表达血红蛋白VHb和纤维素酶蛋白的构建方法，其步骤1)中描述的EGII基因，其氨基酸序列如***所示。
- 8.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中共表达血红蛋白VHb和纤维素酶蛋白的构建方法，其步骤2)中描述的表达载体，为pPIC9K-eg2表达载体。
- 9.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中共表达血红蛋白VHb和纤维素酶蛋白的构建方法，其步骤5)中描述的表达载体，为pPIC9K-vgb表达载体。
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