本发明属于生物工程技术领域,涉及利用葡萄糖产丁二酸的基因工程菌株及其发酵产酸方法。本发明的产丁二酸基因工程菌菌株分类命名为大肠埃希氏菌BA205,其保藏号登记号为CCTCCNO:M2011447。其构建过程主要以缺乏乳酸脱氢酶(LDH)基因,丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大肠杆菌为出发菌株,利用同源重组技术敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因,并过量共表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和烟酸磷酸核糖转移酶后,大幅度提高了丁二酸的合成效率。其发酵方法采用两阶段发酵方式,有氧阶段提高生物量,厌氧阶段发酵产酸。