本发明属于生物工程技术领域,涉及一种两阶段发酵生产苹果酸的方法。本发明的技术要点在于种子培养、两阶段发酵方法利用埃希氏菌属大肠埃希氏菌EscherichiacoliJM127(***)发酵的过程:有氧发酵阶段提高菌体生物量,再厌氧发酵阶段发酵产苹果酸;其特征在于在有氧阶段添加乙酸盐。对于分子改造后埃希氏菌属大肠埃希氏菌EscherichiacoliJM127耗糖能力下降,限制了产酸能力的问题,采用了发酵调控的手段得以解决,即在有氧阶段补加乙酸盐为唯一碳源进行连续诱导,使其耗糖能力提高,加强了发酵产酸的能力,发酵结束对苹果酸的积累有明显的作用。