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本发明为一种蝙蝠草多糖的分离纯化方法，包括蝙蝠草多糖的提取和蝙蝠草多糖的纯化两个步骤，首先以无水乙醇除杂后将蝙蝠草全草的残渣用沸水提取，提取液冷却后离心取上清液，将上清液减压浓缩以后加入无水乙醇沉淀、静置，得到沉淀物再次离心，离心后取上清液再加入乙醇沉淀，重复操作后得到最终沉淀物除去蛋白冷冻干燥得到蝙蝠草多糖初品，将初品依次经过离子交换色谱柱分离纯化、透析、琼脂糖凝胶柱分离纯化后干燥得到蝙蝠草多糖。通过该方法能够提取到均一成分的蝙蝠草多糖，该多糖具有清除自由基及提高免疫力的作用，且提取方法简单、无污染、适于工业化生产。

技术领域

[0001]本发明涉及天然产物分离纯化领域，具有涉及一种蝙蝠草多糖分离纯化方法。

背景技术

[0002]多糖（polysaccharides）是由单糖连接形成的大分子物质，不同生物体内提取的多糖具有不同的生理作用。蝙蝠草为我国壮族的传统民族草药，来源于豆科蝙蝠草属植物蝙蝠草（Christia vespertilionis (L. f.) Bahn. f.），主要分布于我国广西、广东、海南岛。当地民间以其全草代茶饮，也以全草入药，水煎服主治肺结核、痈肿疮毒等。目前，对蝙蝠草的现代化研究报道很少，并仅局限于资源分布、种属鉴别、栽种用途，对蝙蝠草化学成分的研究至今未见报道，蝙蝠草多糖的研究亦属空白。

发明内容

[0003]本发明的目的在于提供一种分离纯化蝙蝠草多糖的方法，希望能够提取出一种新型多糖，该多糖具有独特的功效，能够为蝙蝠草资源的开发利用提供技术指导。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

[0004]一种蝙蝠草多糖的分离纯化方法，包括蝙蝠草多糖的提取和蝙蝠草多糖的纯化两个步骤，

[0005]所述蝙蝠草多糖的提取包括以下步骤：

[0006]a.水提：蝙蝠草全草以无水乙醇回流提取1~3次后得到残渣，所述残渣以沸水提取20~60min得到沸水提取混合物，所述沸水提取混合物冷却后以2500~3500r/min离心取上清液，所述上清液50℃减压浓缩得浓缩提取液；

[0007]b.醇沉：将步骤a所得的浓缩提取液冷却至20℃加入无水乙醇，至提取液中乙醇的体积分数为80%，将提取液置于0~4℃放置10~14小时后取出，弃去上清液得沉淀物；将所述沉淀物挥干乙醇后以水溶解再次离心，离心后取上清液再次以80%乙醇沉淀，0~4℃ 放置10~14小时后弃上清液得二次沉淀物，重复此处理2~5次，得到的最终沉淀物加水制备成水溶液；

[0008]c.除蛋白：将步骤b所得的水溶液以Sevag法除蛋白10~15次后浓缩水层得粗多糖溶液；

[0009]d.冷冻干燥：将步骤c所得的粗多糖溶液冷冻干燥得蝙蝠草粗多糖，分别以无水乙醇、丙酮洗涤蝙蝠草粗多糖2~5次后，真空冷冻干燥，即得蝙蝠草多糖初品；

[0010]所述蝙蝠草多糖的纯化为将所述蝙蝠草多糖初品依次经过离子交换色谱柱分离纯化、透析、琼脂糖凝胶柱分离纯化后干燥得到蝙蝠草多糖。

[0011]作为对纯化步骤的改进，所述蝙蝠草多糖的纯化包括以下步骤:

[0012]a. 离子交换色谱柱分离纯化：将所述蝙蝠草多糖初品加蒸馏水溶解，料液比为5~7g/100ml，以离子交换色谱柱分离，分别采用蒸馏水及0.18~0.22mol/L NaCl溶液洗脱；

[0013]b. 透析：将步骤a中NaCl溶液洗脱部分浓缩后以截留分子量2000Da的透析袋进行透析，先以自来水透析，再以蒸馏水透析；

[0014]c.琼脂糖凝胶柱分离纯化：步骤b中透析后截留物质通过琼脂糖凝胶柱分离纯化，以蒸馏水洗脱，弃去前端1.5倍凝胶柱体积的洗脱液，收集后续1倍凝胶柱体积的洗脱液干燥。

[0015]进一步的，蝙蝠草多糖的纯化步骤a中称取5~7g所述蝙蝠草多糖初品溶于100ml蒸馏水中，离子交换色谱柱柱体积500mL，NaCl溶液浓度为0.2mol/L；步骤b中自来水透析时间为2天，蒸馏水透析时间为1天；步骤c中琼脂凝胶柱柱体积200mL，弃去前300mL洗脱液，收集后续200mL洗脱液。

[0016]本发明的另一目的是通过以下方案实现的：

[0017]一种利用上述分离纯化方法得到的蝙蝠草多糖。

[0018]进一步的，所述蝙蝠草多糖为均一组分。

[0019]进一步的，所述蝙蝠草多糖的分子量为220000Da。

[0020]进一步的，所述蝙蝠草多糖的旋光度为+38.5°。

[0021]进一步的，所述蝙蝠草多糖由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖组成，其物质的量的比为2.44:1:6.54:1.28。

[0022]本发明的另一目的是通过以下方案实现的：

[0023]一种利用上述分离纯化方法得到的蝙蝠草多糖在抗氧化和提高免疫力方面的应用。

[0024]本发明的有益效果：

[0025]本发明提供了一种操作简便、无污染、适合工业化生产的提取分离纯化蝙蝠草多糖的方法，填补了目前蝙蝠草成分分析、提取的空白；通过本发明的方法提取的蝙蝠草多糖为均一组分，该多糖在清除DPPH自由基、提供机体免疫力方面具有一定功效，有潜力被开发应用于医用、保健领域，制备成抗氧化、抗炎性、治疗免疫性疾病类药物。