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一种5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶突变体

发布时间: 2022-04-01

基本信息

合作方式： 技术转让
成果类型： 发明专利
行业领域：
其他
成果介绍

本发明公开了一种5 羰基 2 戊烯酰基辅酶A还原酶突变体,属于生物工程领域。本发明对产己二酸代谢途径3 氧代己二酰辅酶A途径中的限速基因Tfu_1647进行定点突变,得到一株己二酸产量提高的突变体。采用本发明的突变菌株发酵24h,己二酸产量由对照菌株的***提高到***,提高了近5倍。采用本发明的突变体,大大提高了己二酸产量,降低生产成本,促进己二酸在工业上的推广应用。

  • 1.一种5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶突变体，其特征在于，所述突变体相对于5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶亲本，将第334位的谷氨酸突变为精氨酸；所述5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶亲本的氨基酸序列如SEQ ID ***所示。
  • 2.编码权利要求1所述突变体的基因。
  • 3.含有编码权利要求1所述突变体核苷酸序列的重组质粒载体。
  • 4.表达权利要求1所述突变体的重组细胞。
  • 5.根据权利要求4所述重组细胞，其特征在于，所述重组细胞还表达了氨基酸序列如SEQ ID ***所示的β-酮硫解酶，氨基酸序列如SEQ ID ***所示的3-羟酰基-辅酶A脱氢酶，氨基酸序列如SEQ ID ***所示的3-羟基己二酰脱氢酶，氨基酸序列如SEQ ID ***所示的琥珀酰辅酶A合成酶，以及氨基酸序列如SEQ ID ***所示的琥珀酰辅酶A合成酶。
  • 6.根据权利要求4所述重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母。
  • 7.根据权利要求4所述重组细胞，其特征在于，所述重组细胞的构建方法是： (1)设计定点突变所用引物，以携带5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶亲本基因的载体为模板进行突变并构建突变体的质粒载体；其中质粒载体是指在质粒pTrc99A上连接氨基酸序列如SEQ ID ***所示的3-羟基己二酰脱氢酶的基因和氨基酸序列如SEQ ID ***所示的5-羰基-2-戊烯酰基辅酶A还原酶基因； (2)将突变质粒转化进宿主细胞； (3)将连接了氨基酸序列如SEQ ID ***所示的β-酮硫解酶基因和氨基酸序列如SEQID ***所示的3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因的质粒pRSF转化进宿主细胞； (4)将连接了氨基酸序列如SEQ ID ***所示的琥珀酰辅酶A合成酶基因和氨基酸序列如SEQ ID ***所示的琥珀酰辅酶A合成酶基因的质粒pCD转化进宿主细胞，最终得到重组细胞。
  • 8.权利要求1所述突变体在生产己二酸中的应用。
  • 9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述应用是将含有权利要求1所述突变体的单菌落接入含有Kan，Amp，Str三种抗生素的LB培养基中，35-38℃，200-250r/min摇床培养过夜得到种子液，将种子液以2-5％接种量接入到发酵培养基中，待菌体生长至OD＝***左右，加入IPTG诱导，然后转入28-32℃培养。
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