本发明提供了CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法,其能解决现有构建方法操作要求以及试剂配制要求较高受,普通技术人员获得的菌株阳性率低,阳性菌株挑选费时费力的技术问题。CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法,其包括以下步骤:(1)制备线性化的sgRNA空质粒;(2)制备区分片段;(3)制备重组sgRNA骨架载体;(4)挑选重组sgRNA骨架载体;其特征在于:所述步骤(2)的区分片段包含sacB基因及其开放阅读框(ORF)、启动子和终止子。

• ***系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法，其包括以下步骤： （1）制备线性化的sgRNA空质粒，采用的sgRNA空质粒具有一对对称的IIS型内切酶酶切位点，所述sgRNA空质粒通过IIS型内切酶进行酶切，胶回收酶切后的线性化的sgRNA空质粒； （2）制备区分片段，所述区分片段两端具有与IIS型内切酶酶切后对应的末端片段； （3）制备重组sgRNA骨架载体，将步骤（1）胶回收的所述线性化的sgRNA空质粒与步骤（2）制备的区分片段连接，制备重组sgRNA骨架载体； （4）挑选重组sgRNA骨架载体，将步骤（3）的sgRNA骨架载体转化大肠杆菌，涂抗性平板，形成单克隆，挑单克隆用含有所述IIS型内切酶酶切位点接头的引物进行菌落PCR鉴定； 其特征在于： 所述步骤（2）的区分片段包含sacB基因及其开放阅读框（ORF）、启动子和终止子，所述sacB基因的核苷酸序列如SEQ ID ***所示； 所述步骤（2）制备区分片段，根据pK18mobSacB载体图谱和序列设计一对含有上述IIS型内切酶酶切位点接头的引物，该引物的扩增子应包含sacB基因的ORF及其启动子和终止子，用该引物对pK18mobSacB载体进行PCR，获得目的片段，胶回收PCR产物，用IIS型内切酶对其进行酶切，柱纯化后得到区分片段； 所述步骤（4）还包括将PCR鉴定阳性的菌分别涂LB抗性板和含5%~10%蔗糖的LB抗性板，若在含5%~10%蔗糖的LB抗性板上无法生长而在LB抗性板上形成菌苔，则表面该菌含有构建成功的重组sgRNA骨架载体。
• 2.根据权利要求1所述的CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法，其特征在于：步骤（1）制备线性化的sgRNA空质粒，若已有sgRNA空质粒，则用相应的IIS型内切酶直接对其进行酶切，酶切后胶回收得到线性化的sgRNA空质粒；或者根据已构建入某sgRNA的质粒，设计引物对此质粒进行全质粒PCR，以获取含有IIS型内切酶酶切接头的sgRNA空质粒，随后同样用IIS型内切酶对其进行酶切，胶回收酶切后的线性化的sgRNA空质粒。
• 3.根据权利要求1所述的CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法，其特征在于：步骤（3）制备重组sgRNA骨架载体，将步骤（1）胶回收的所述线性化的sgRNA空质粒与步骤（2）制备的区分片段混匀，加入T4连接酶以及T4连接酶Buffer，置于16°金属浴过夜连接。
• 4.根据权利要求1所述的CRIPSR/Cas9系统中重组sgRNA骨架载体的构建方法，其特征在于：步骤（4）挑选重组sgRNA骨架载体，将步骤（3）的连接产物转化大肠杆菌，涂抗性平板，培养12~20小时至平板上形成单克隆，挑单克隆并用步骤（2）中所述引物进行菌落PCR鉴定，PCR鉴定阳性的菌落转入摇瓶培养过夜，随后进行质粒抽提，用所述IIS型内切酶酶切质粒，将酶切鉴定正确的克隆摇过夜，稀释后分别涂LB抗性板和含5%-10%蔗糖的LB抗性板，若在含5%-10%蔗糖的LB抗性板上无法生长而在LB抗性板上形成菌苔，则表明菌中含有构建成功的重组sgRNA骨架载体。