本发明公开了一种酶法转化生产9α 羟基雄甾 4 烯 3,17 二酮的方法,属于基因工程和酶工程领域。本发明将来源于Mycobacterium *** VKMAc 1817D的3 甾酮9α 羟基化酶的氧化亚基KshA,还原亚基KshB,及未知活性亚基KshC成功在***中表达,并鉴定出KshC为氧化亚基,且酶活远高于KshA。利用本实验室已构建的BL21/pET 28a(+) fdh表达甲酸脱氢酶FDH,以KSH(KshB+KshC)和FDH工程菌的粗酶液作为生物催化剂,以甾体化合物AD为底物,同时确定了最佳反应温度为30℃,***。在最优条件下转化AD生成产物9 OH AD,在20小时内,9 OH AD的产量为***,摩尔转化率达到***%。本发明产生9 OH AD实现了3 甾酮9α 羟基化酶羟化系统与辅酶循环体系的偶联,具有效率高,成本低,绿色环保等优点。

• 1.一种转化雄甾-4-烯-3,17-二酮生成9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮的组合物，其特征在于，所述组合物包括由3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB和3-甾酮9α-羟基化酶氧化亚基KshC组成的3-甾酮9α-羟基化酶混合酶液；编码所述3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB的基因的核苷酸序列如SEQ ID ***所示；编码所述3-甾酮9α-羟基化酶氧化亚基KshC的基因的核苷酸序列如SEQ ID ***所示。
• 2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括辅酶NAD+、NADH、甲酸脱氢酶或三者的任意组合。
• 3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB的氨基酸序列为SEQ ID ***。
• 4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述3-甾酮9α-羟基化酶氧化亚基KshC的氨基酸序列为SEQ ID ***。
• 5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物为由3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB和3-甾酮9α-羟基化酶氧化亚基KshC组成的3-甾酮9α-羟基化酶混合酶液、NADH和甲酸脱氢酶组成。
• 6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述3-甾酮9α-羟基化酶氧化亚基KshC、3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB与甲酸脱氢酶按酶活添加比例为1～10:1～10:1～10。
• 7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述NADH的添加量为***～1mol/L。
• 8.权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征在于，所述方法具体是： (1)以SEQ ID ***所示核酸序列为模板，扩增得到编码3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB的基因，将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a上，获得重组质粒pET-28a-kshB； (2)以SEQ ID ***所示核酸序列为模板，扩增得到编码3-甾酮9α-羟基化酶氧化亚基KshC的基因，将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-Duet1(+)上，获得重组质粒pET-Duet1(+)-kshC； (3)将步骤(1)和步骤(2)的重组质粒分别转化至大肠杆菌中获得重组大肠杆菌BL21/pET-28a(+)-kshB和BL21/pET-Duet1(+)-kshC； (4)利用步骤(3)的重组大肠杆菌发酵获得3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB和3-甾酮9α-羟基化酶氧化亚基KshC组成的3-甾酮9α-羟基化酶混合酶液。
• 9.一种提高雄甾-4-烯-3,17-二酮转化生成9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮效率的方法，所述方法是利用权利要求1所述的组合物作为催化剂，进行生物转化。
• 10.权利要求1所述的组合物在生产甾体化合物领域的应用。