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一株酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用

发布时间: 2022-03-30

基本信息

合作方式： 技术转让
成果类型： 发明专利
行业领域：
其他
成果介绍

一种酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用,属于基因工程和酶工程技术领域。该精氨酸脱亚胺酶突变体为酶活性中心附近的甘氨酸突变为脯氨酸,即Gly292 Pro。本发明利用定点突变技术对野生型精氨酸脱亚胺酶arcA编码基因进行分子改造,得到了一种突变体酶ADIG292P,相对于野生型精氨酸脱亚胺酶氨基酸序列的第292位甘氨酸突变为脯氨酸。本发明所述的定点突变改造的精氨酸脱亚胺酶与野生酶相比其酶活力提高了***倍,在40℃下的半衰期提高了***倍,解决了精氨酸脱亚胺酶催化瓜氨酸合成时,催化能力和温度稳定性低的问题,为高效合成瓜氨酸的工业化生产及医药应用奠定了基础。

  • 1.一种酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ***。
  • 2.权利要求1所述的酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体的基因DNA，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID ***所示。
  • 3.一种重组质粒，其特征在于包含了权利要求2所述的DNA分子。
  • 4.一种宿主细胞，其特征在于其含有如权利要求2所述的DNA分子，或含有如权利要求3所述的重组质粒。
  • 5.根据权利要求1所述的酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征在于，将含有精氨酸脱亚胺酶突变体基因序列DNA的重组质粒转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)宿主中，构建突变体，进行序列验证确认，得到一株酶活和温度稳定性提高的突变体Gly292Pro。
  • 6.权利要求1所述的酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤： 1）根据Enterococcus faecalis ***的精氨酸脱亚胺酶arcA基因序列设计引物，以含有精氨酸脱亚胺酶序列的Enterococcus faecalis ***为模板，通过PCR的方法获得含有精氨酸脱亚胺酶arcA的基因片段，与表达载体pET-28a连接构建重组质粒； 2）利用B-FITTER软件识别出酶分子中对温度稳定性有不利影响的关键氨基酸残基，然后利用SWISS-MODEL软件对亲本精氨酸脱亚胺酶进行蛋白结构模拟，获得精氨酸脱亚胺酶三级结构；通过分析对比，确定要突变的氨基酸位点为第292位甘氨酸； 3）设计突变引物，使用一步PCR法对精氨酸脱亚胺酶的核苷酸序列进行定点突变，将所述第292位的氨基酸进行替换，获得含精氨酸脱亚胺酶突变体基因序列的重组载体； 4）将含有精氨酸脱亚胺酶突变体基因序列的重组载体通过热激转化进入大肠杆菌***(DE3)感受态细胞中，并诱导表达，收集菌体，超声破碎细胞后使用Ni-NTA进行蛋白分离纯化，获得精氨酸脱亚胺酶突变体。
  • 7.权利要求1所述的酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体的应用，其特征在于，所述的精氨酸脱亚胺酶突变体用于瓜氨酸的生产。
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