一种襄麦冬内生曲霉属的菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种襄麦冬内生曲霉属的菌株及其应用。

背景技术

湖北麦冬多糖，是国家地理标志产品、湖北道地中药材植物——襄麦冬，即湖北麦冬Liriope spicata *** ***块根的主要活性成分之一，研究表明：湖北麦冬多糖具有抗心肌缺血、抗血栓形成、耐缺氧、抗衰老、降血糖等方面的药理作用，它对改善机体免疫系统、增进胃肠运动机能等方面都有着积极的影响，最新的研究表明它还具有抗肿瘤作用。

传统的湖北麦冬多糖生产，主要还是通过直接分离襄麦冬块根提取物获得。但是，在襄麦冬实际种植生产中，存在着诸如“受连作障碍导致种植面积相对较小”、“受气候条件影响较大”、“块根生产周期长”、“多糖提取成本高”等因素，导致湖北麦冬多糖的市场投放受到限制。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种襄麦冬内生曲霉属的菌株及其应用，旨在解决襄麦冬药材种植生产中的各种不利因素导致湖北麦冬多糖的市场投放受到限制的问题。

为实现上述目的，本发明提出一种襄麦冬内生曲霉属的菌株，所述襄麦冬内生曲霉属的菌株为曲霉属(Aspergillus sp.)菌EF063，保藏编号为CCTCC No：M2018784，保藏时间为2018年11月12日。

可选地，所述襄麦冬内生曲霉属的菌株的18S rRNA基因序列如SEQ ID NO：1所示。

可选地，如上所述襄麦冬内生曲霉属的菌株通过以下筛选方法获得：

将清洗干净的新鲜襄麦冬植物块根用75％(V/V)乙醇浸泡2min，用无菌水漂洗；再用有效氯含量4～6％的次氯酸钠溶液浸泡所述襄麦冬块根2min，最后用无菌水漂洗、蘸干；

将上述处理的襄麦冬块根在无菌条件下剪去两头褐变部分，切割成***×***组织小片，置于PDA培养基(含氨卞青霉素，终浓度为50ug/mL)上，每皿植入2片，用parafiLm封口膜将培养皿密封后置于28℃恒温培养；

挑取所述PDA培养基上中间深黄色，边缘白色的菌落顶端菌丝，转移至新鲜的PDA培养基中进行多次纯化培养直至仅长出单一纯菌落，即曲霉属(Aspergillus sp.)菌EF063。

本发明通过上述筛选方法获得的襄麦冬内生曲霉属的菌株，可通过液体发酵生产湖北麦冬多糖。现有技术的湖北麦冬多糖生产主要是通过直接分离襄麦冬块根提取物获得，本发明提供的襄麦冬内生曲霉属的菌株可以应用于制备湖北麦冬多糖，从而避免现有制备湖北麦冬多糖的方法中化学合成对环境造成的污染，更能规避襄麦冬药材种植生产中的各种不利因素，是寻找湖北麦冬多糖新资源的重要微生物，具有较大的应用价值。

本发明还提出一种如上所述的襄麦冬内生曲霉属的菌株的应用，采用所述的襄麦冬内生曲霉属的菌株通过液体发酵制备得到湖北麦冬多糖。

可选地，所述湖北麦冬多糖的制备方法包括以下步骤：

取上述的襄麦冬内生曲霉属的菌株，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的PDA培养基试管，于28℃活化培养72小时；

取活化培养后的菌株，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体马铃薯种子培养基中，28℃下180rpm振荡培养72小时，得种子；

将配制好的液体发酵培养基分别装入250mL的三角瓶中，每瓶约100mL，灭菌处理，冷却备用；无菌条件下，按照10％的接种量接入种子，28℃下180rpm振荡培养7天；

发酵完毕，将发酵固液混合物置于超低温冰箱中快速冷冻成固态后，使用小型冷冻干燥机进行低温冷冻干燥处理，得到干燥的发酵产物；

将低温冷冻干燥的菌株发酵产物研成粉末，分别重复三次加入100mL95％乙醇，对粉碎物进行洗涤，烘干；

将烘干样品按1∶10(g/mL)加蒸馏水，80℃水浴2h后过滤，对滤渣再重复上述操1次；

合并提取液，离心，取上清液透析48h；

透析后减压浓缩得浸膏，再用100mL95％乙醇对其进行醇沉；

醇沉产物依次经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，干燥，得到湖北麦冬多糖。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中曲霉属菌EF063在PDA培养基上的形态图；

图2为阳性对照的湖北麦冬块根提取的多糖的酸解单糖的HPLC检测图；

图3为本发明实施例2中菌产多糖的酸解单糖的HPLC检测图；

图4为本发明实施例2中菌产多糖的OH、O2-、DPPH、ABTS自由基的清除活性。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

现有的湖北麦冬多糖生产，主要还是通过直接分离襄麦冬块根提取物获得。但是，在襄麦冬实际种植生产中，存在着诸如“受连作障碍导致种植面积相对较小”、“受气候条件影响较大”、“块根生产周期长”、“多糖提取成本高”等因素，导致湖北麦冬多糖的市场投放受到限制。

鉴于此，本发明提出一种襄麦冬内生曲霉属的菌株，所述襄麦冬内生曲霉属的菌株为曲霉属(Aspergillus sp.)菌EF063，保藏编号为CCTCC No：M2018784，保藏时间为2018年11月12日。具体地，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，具体地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学内。所述曲霉属菌EF063中间深黄色，边缘白色，单菌落为圆形。

曲霉属(Aspergillus sp.)菌EF063的形态及18S rRNA序列对比结果如下：

所述曲霉属(Aspergillus sp.)菌EF063在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上28℃培养，菌落为圆形，中间深黄色，边缘白色，如图1所示；

本发明所述的曲霉属(Aspergillus sp.)菌EF063的18S rRNA基因序列，如SEQ IDNO：1所示；将测序结果于NCBI网站进行序列比对(***)。同Aspergillus sp.，***，同源性99％。因此，该菌为曲霉属(Aspergillus sp.)，并将该菌株命名为曲霉属(Aspergillus sp.)菌EF063。

其中，所述襄麦冬内生曲霉属的菌株的筛选方法包括以下步骤：

步骤S10、将清洗干净的新鲜襄麦冬植物块根用75％(V/V)乙醇浸泡2min，用无菌水漂洗；再用有效氯含量4～6％的次氯酸钠溶液浸泡所述襄麦冬块根2min，最后用无菌水漂洗、蘸干；

具体地，使用大量自来水充分清洗新鲜襄麦冬块根表面泥土，然后装入干净的烧杯中，加入去离子水，置于超声波清洗器中反复清洗，直至清洗后的水变得极为清澈；用无菌滤纸蘸干湖北麦冬块根表面的水分后，再按下述步骤处理：先用75％(V/V)乙醇浸泡块根2min，用无菌水漂洗3次；再用有效氯含量4-6％的次氯酸钠溶液浸泡2min，后用大量无菌水连续漂洗4次，再用无菌滤纸蘸干水分。

步骤S20、将上述处理的襄麦冬块根在无菌条件下剪去两头褐变部分，切割成***×***组织小片，置于PDA培养基(含氨卞青霉素，终浓度为50ug/mL)上，每皿植入2片，用parafiLm封口膜将培养皿密封后置于28℃恒温培养；

具体地，取上述表面消过毒的襄麦冬块根样品，无菌条件下剪去块根两头褐变部分，剩余部分用解剖刀片切割成***×***组织小片(横向切片、纵向切片)，尽可能切割薄一些以便其能与培养基表面充分接触，有利于真菌从培养基中吸收养分，置于PDA培养基(含氨卞青霉素，终浓度为50ug/ml)上，用镊子均匀的在组织小片上轻轻压一压，使其紧紧贴服于平板上，每皿植入2片，并设五个重复，最后用parafilm封口膜将培养皿密封后置于28℃恒温培养。

步骤S30、挑取所述PDA培养基上中间深黄色，边缘白色的菌落顶端菌丝，转移至新鲜的PDA培养基中进行多次纯化培养直至仅长出单一纯菌落，即曲霉属(Aspergillus sp.)菌EF063。

具体地，每天观察样品真菌生长的情况，5～7天后组织小片周边长出菌丝，形成一个个颜色、形状等均不相同的菌落；挑取所述PDA培养基上中间深黄色，边缘白色的菌落顶端菌丝，转移至新鲜的PDA培养基中进行多次纯化培养直至仅长出单一纯菌落，采用分子生物学技术对上述纯化所获得的菌落进行分子鉴定，最终得到本发明的襄麦冬内生曲霉属的菌株EF063，其分类命名为曲霉属Aspergillus sp.，保藏编号为CCTCC No：M2018784。

本发明通过上述筛选方法获得的曲霉属(Aspergillus sp.)菌EF063，可通过液体发酵生产湖北麦冬多糖。现有技术的湖北麦冬多糖生产主要是通过直接分离麦冬块根提取物获得，本发明提供的襄麦冬内生曲霉属的菌株可以应用于制备湖北麦冬多糖，从而避免现有制备湖北麦冬多糖的方法中化学合成对环境造成的污染，更能规避襄麦冬药材种植生产中的各种不利因素，是寻找湖北麦冬多糖新资源的重要微生物，具有较大的应用价值。

进一步地，本发明还提出一种如上所述的襄麦冬内生曲霉属的菌株的应用，采用所述的襄麦冬内生曲霉属的菌株通过液体发酵制备得到湖北麦冬多糖。

上述湖北麦冬多糖的制备方法包括以下步骤：

步骤A10、取上述的曲霉属(Aspergillus sp.)菌EF063，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的PDA培养基试管，于28℃活化培养72小时；

步骤A20、取活化培养后的菌株，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体马铃薯种子培养基中，28℃下180rpm振荡培养72小时，得种子；

步骤A30、将配制好的液体发酵培养基分别装入250mL的三角瓶中，每瓶约100mL，灭菌处理，冷却备用；无菌条件下，按照10％的接种量接入种子，28℃下180rpm振荡培养7天；

步骤A40、发酵完毕，将发酵固液混合物置于超低温冰箱中快速冷冻成固态后，使用小型冷冻干燥机进行低温冷冻干燥处理，得到干燥的发酵产物；

步骤A50、将低温冷冻干燥的菌株发酵产物研成粉末，分别重复三次加入100mL95％乙醇，对粉碎物进行洗涤，烘干；

步骤A60、将烘干样品按1∶10(g/mL)加蒸馏水，80℃水浴2h后过滤，对滤渣再重复上述操1次；

步骤A70、合并提取液，离心，取上清液透析48h；

步骤A80、透析后减压浓缩得浸膏，再用100mL95％乙醇对其进行醇沉；

步骤A90、醇沉产物依次经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，干燥，得到湖北麦冬多糖。

以下给出发酵制备湖北麦冬多糖的一具体实施例：

取上述的曲霉属(Aspergillus sp.)菌EF063，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的PDA培养基试管，于28℃活化培养72小时；取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体马铃薯种子培养基中，28℃下180rpm振荡培养72小时，得种子；将配制好的液体发酵培养基分别装入250ml的三角瓶中，每瓶约100ml，灭菌处理，冷却备用；无菌条件下，按照10％的接种量接入种子，28℃下180rpm振荡培养7天；发酵完毕，将发酵固液混合物置于超低温冰箱中快速冷冻成固态后，使用小型冷冻干燥机进行低温冷冻干燥处理，得到干燥的发酵产物；将低温冷冻干燥的菌株发酵产物研成粉末，分别重复三次加入100ml95％乙醇，对粉碎物进行洗涤，烘干；将烘干样品按1∶10(g/mL)加蒸馏水，80℃水浴2h后过滤，对滤渣再重复上述操1次；合并提取液，离心，取上清液透析48h；透析后减压浓缩得浸膏，再用100ml 95％乙醇对其进行醇沉；醇沉产物依次经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，干燥，得到湖北麦冬多糖。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1产生湖北麦冬多糖的菌株的筛选

(1)使用大量自来水充分清洗湖北麦冬块根表面泥土，然后装入干净的烧杯中，加入去离子水，置于超声波清洗器中反复清洗，直至清洗后的水变得极为清澈；用无菌滤纸蘸干湖北麦冬块根表面的水分后，再按下述步骤处理：先用75％(V/V)乙醇浸泡块根2min，用无菌水漂洗3次；再用有效氯含量4-6％的次氯酸钠溶液浸泡2min，后用大量无菌水连续漂洗4次，再用无菌滤纸蘸干水分；

(2)取上述表面消过毒的湖北麦冬块根样品，无菌条件下剪去块根两头褐变部分，剩余部分用解剖刀片切割成***×***组织小片(横向切片、纵向切片)，尽可能切割薄一些以便其能与培养基表面充分接触，有利于真菌从培养基中吸收养分，置于PDA培养基(含氨卞青霉素，终浓度为50ug/ml)上，用镊子均匀的在组织小片上轻轻压一压，使其紧紧贴服于平板上，每皿植入2片，并设五个重复，最后用parafilm封口膜将培养皿密封后置于28℃恒温培养；

(3)每天观察样品真菌生长的情况，5～7天后组织小片周边长出菌丝，形成一个个颜色、形状等均不相同的菌落；随机挑取上述不同菌落的菌丝尖端转移至新鲜的PDA培养基中进行多次纯化培养直至仅长出单一纯菌落，分别进行编号和采用分子生物学技术对上述纯化所获得的菌落进行分子鉴定，最终得到曲霉属(Aspergillus sp.)菌EF063。

实施例2湖北麦冬多糖的制备

取上述的曲霉属菌EF063，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的PDA培养基试管，于28℃活化培养72小时；取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体马铃薯种子培养基中，28℃下180rpm振荡培养72小时，得种子；将配制好的液体发酵培养基分别装入250ml的三角瓶中，每瓶约100ml，灭菌处理，冷却备用；无菌条件下，按照10％的接种量接入种子，28℃下180rpm振荡培养7天；发酵完毕，将发酵固液混合物置于超低温冰箱中快速冷冻成固态后，使用小型冷冻干燥机进行低温冷冻干燥处理，得到干燥的发酵产物；将低温冷冻干燥的菌株发酵产物研成粉末，分别重复三次加入100ml95％乙醇，对粉碎物进行洗涤，烘干；将烘干样品按1∶10(g/mL)加蒸馏水，80℃水浴2h后过滤，对滤渣再重复上述操1次；合并提取液，离心，取上清液透析48h；透析后减压浓缩得浸膏，再用100ml95％乙醇对其进行醇沉；醇沉产物依次经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，干燥，得到湖北麦冬多糖。

实施例3菌株鉴定

(1)菌种培养基形态特征鉴定

将实施例1获得的曲霉属菌EF063划线于PDA培养基平板，于28℃培养24h，观察菌落形状、大小、颜色等特征。其中，PDA培养基还包括浓度为50ug/ml的氨苄青霉素。

观察结果如图1所示，曲霉属菌EF063的菌落为圆形,中间深黄色，边缘白色。

(2)曲霉属菌EF063的18S rRNA测序

如SEQ ID ***所示为曲霉属菌EF063的18S rRNA基因序列，将测序结果于NCBI网站进行序列比对(***)。同Aspergillus sp，***，同源性99％。

(3)发酵产物的颜色反应

采用以下两种颜色反应方法进行检测：

(a)萘酚-浓硫酸反应方法：200ul发酵产物溶液样品溶于400ul15％的1-萘酚中，加浓硫酸100ul，呈蓝紫色为阳性。

(b)蒽酮-浓硫酸反应方法：400ul发酵产物溶液样品，加入300ul蒽酮硫酸溶液，呈蓝绿色为阳性。

曲霉属菌EF063发酵产物的两种反应结果，均呈阳性。即表明曲霉属菌EF063发酵能够产生多糖。

(4)薄层色谱检测(TLC)

取20mg上述制备的曲霉属菌EF063菌产多糖，加入5ml纯水进行溶解，再加入***的12mol/L的HCL，将其置于120-126℃环境中反应4h。中和、透析后稀释至10ml。

以湖北麦冬块根提取的多糖的酸解产物为阳性对照，对曲霉属菌EF063菌产多糖的酸解液进行薄层层析。展开剂为正丁醇：无水乙醇：冰醋酸：纯水＝2:3:1:1(V/V/V/V/V),显色剂为称取4g二苯胺、量取4ml苯胺及20ml85％磷酸溶于200ml丙酮，105℃烘箱中加热3min，直至显出清晰红色斑点为止。

曲霉属菌EF063菌产多糖的酸解单糖与阳性对照酸解单糖有相似的Rf值。即表明曲霉属菌EF063发酵能够产生湖北麦冬多糖。

(5)高效液相色谱检测(HPLC)

取20mg上述制备的曲霉属菌EF063菌产多糖，加入5ml纯水进行溶解，再加入***的12mol/L的HCL，将其置于120-126℃环境中反应4h。中和、透析后稀释至10ml。

取上述制备的曲霉属菌EF063菌产多糖酸解产物1mL置于离心管中，加*** PMP-甲醇溶液及***溶液，涡旋1min，70℃水浴60min冷却至室温，取***溶液中和，氯仿2ml萃取3次，合并水层，水系滤膜过滤，使用前超声***。同时，取湖北麦冬块根提取的多糖的酸解产物，重复上述操作步骤，制备阳性对照样品。

HPLC色谱条件：色谱仪岛津LC-20高效液相色谱仪(检测器：SPD-M20A，柱温箱：CTO-20A并配真空脱气机DGU-20A3，色谱柱Inert Sustain C18)；利用乙腈：磷酸盐缓冲溶液(pH＝***)＝20:80进行等度洗脱，流速1mL/min；光谱数据采集通道：ch1(250nm)；进样量10μL；记录30min数据；信号强度单位为mAU。

图2是阳性对照湖北麦冬块根提取的多糖酸解产物的HPLC检测图，图3为本发明实施例2中菌产多糖的酸解单糖的HPLC检测图。经过图谱比对表明曲霉属菌EF063发酵能够产生湖北麦冬多糖。

(6)发酵产物抗氧化性测定

采用α-脱氧核糖法、邻苯三酚自氧化法、DPPH法和ABTS法，分别测试Fungal属菌EF028菌产多糖对OH、O2-、DPPH、ABTS自由基的清除活性。

图4是曲霉属菌EF063菌产多糖对OH、O2-、DPPH、ABTS自由基的清除活性。由图4可知，曲霉属菌EF063发酵产物对四种自由基(DPPH、O2-、OH、ABTS)均具有一定的体外清除活性，抗氧化能力与浓度呈正相关。

综上所述，本发明提供的曲霉属菌EF063的菌落为圆形，中间深黄色，边缘白色；同Aspergillus sp.，***，同源性99％；曲霉属菌EF063菌产多糖的两种反应结果，均呈阳性；并且曲霉属菌EF063菌产多糖的酸解单糖与阳性对照酸解单糖有相似的Rf值，以及曲霉属菌EF063菌产多糖酸解产物与阳性对照HPLC比对图谱均表明曲霉属菌EF063发酵能产生湖北麦冬多糖；其发酵产生的湖北麦冬多糖具有一定的体外清除活性，表明曲霉属菌EF063性能良好，能够广泛应用于生产中。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内