本发明公开了一种重组脯氨酸氨肽酶发酵高产及制备脱苦大米肽的方法,属于发酵技术、酶制剂、食品添加剂领域。本发明利用发酵动力学分析确定重组枯草芽孢杆菌高产脯氨酸氨肽酶的发酵方法,提高了脯氨酸氨肽酶的产量,达到***。脯氨酸氨肽酶协同碱性蛋白酶和亮氨酸氨肽酶水解大米蛋白,游离氨基酸为未水解前的游离氨基酸含量的***倍,水解液中180Da以下的小肽含量达到了***%,充分水解了暴露出的N端脯氨酸残基,游离的脯氨酸含量是未水解游离脯氨酸含量的***倍,提高了大米蛋白水解深度。本发明方法在食品和饮料及在食品蛋白资源加工利用领域具有很好的应用前景。