一种淡水鱼抗氧化物活性肽的制备方法,包括,将淡水鱼鱼糜与NaCl溶液混合,均质搅拌离心后取沉淀,加入CaCl2和柠檬酸混合液,均质搅拌离心后取沉淀冻干,得到预处理后的鱼糜;对预处理后的鱼糜进行碱性蛋白酶酶解、胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶和糜蛋白酶酶解,离心收集上清液冻干,得到鱼蛋白酶解物;将制得的蛋白酶解物溶解于水,逐级过滤膜,将透过液冻干,得到淡水鱼抗氧化物活性肽。本发明淡水鱼蛋白酶解物和抗氧化肽是以天然产物为原料,所得产品安全、无毒、无腥味和泥土味,溶解性好,能被人体吸收利用且感官品质优良,能广泛应用于功能食品中。