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需求企业已经完成小试及工艺路线开发，需要进一步完成放大工艺及实现产业化。

据了解，胆固醇氧化酶(cholesterol oxidase，EC 11.3.6)简称COD，是胆固醇降解代谢过程中的第一个酶，能专一性地催化底物胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮。微生物是胆固醇氧化酶最为主要的来源，其在临床诊断、食品加工、生物制药、生物化学和抗虫领域有着广泛的应用。如：利用胆固醇氧化酶测定血清中胆固醇的含量就成了临床诊断中一个重要的参考指标。在食品工业中利用胆固醇氧化酶酶法相较物理、化学法降解胆固醇而言，具有效率高毒副作用低的优势；同时其氧化产物在医药领域也有很好的应用前景。

Brevibacterium(短杆菌)，Streptomyces spp.(链霉菌)，Corynebacterium(棒状杆菌)，Arthrobacter(节杆菌)，Pseudomonas(假单胞菌)和Rhodococcus(红球菌)等微生物都可以生产胆固醇氧化酶。目前，多种胆固醇氧化酶基因已经被克隆，并转入E.coli(大肠杆菌)等基因工程菌进行表达。然而胆固醇氧化酶的分离纯化步骤通常包括了多步的硫酸铵沉淀，表面活化剂处理，热处理，离子交换层析，分子筛层析等。而过多的纯化步骤，导致了纯化时间较长，蛋白和活性回收率较低的结果。

江南大学于2019年4月申请的专利一种胆固醇氧化酶及其应用（CN110004121B号）公开了一种胆固醇氧化酶及其应用，属于酶工程技术领域。本发明首先构建得到胆固醇氧化酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)‑pET20b(+)‑COD，其发酵所得的粗酶液中胆固醇氧化酶酶活高达700U·L‑1，纯化得到的胆固醇氧化酶比酶活为18.5U·mg‑1，其分子量约60,000kDa，该胆固醇氧化酶具有良好的温度耐受性和有机溶剂耐受性。利用工程菌发酵液制备胆甾‑4‑烯‑3‑酮和胆甾‑4‑烯‑3,6‑二酮，在有机相为甲苯的两相转化体系中，以胆固醇为底物制备胆甾‑4‑烯‑3‑酮的转化率为30％；制备胆甾‑4‑烯‑3,6‑二酮的转化率为45％。

宁夏妙朗生物科技有限公司于2010年9月申请的一种胆固醇氧化酶亲和介质及其合成和大规模纯化胆固醇氧化酶方法（CN102380347B）涉及一种胆固醇氧化酶亲和介质，由胆固醇氧化酶亲和配体和层析介质连接而成，较佳地，胆固醇氧化酶亲和配体是FAD片段核黄素，所述层析介质是Sepharose、壳聚糖或聚苯乙烯，还提供了上述胆固醇氧化酶亲和介质的合成方法，以及利用上述的胆固醇氧化酶亲和介质大规模纯化胆固醇氧化酶的方法，利用本发明的胆固醇氧化酶亲和介质可以大规模快速分离纯化胆固醇氧化酶，可在仅用一步亲和层析的情况下，得到胆固醇氧化酶纯品，整个纯化步骤消耗时间段，蛋白和活性回收率较高，适于大规模推广应用。

华东理工大学于2011年申请的胆固醇氧化酶基因和工程菌及应用（CN102168098B）提供了胆固醇氧化酶基因及其编码的胆固醇氧化酶，提供了含有其基因序列的表达载体和含有该表达载体的基因工程重组菌株，提供了制备该胆固醇氧化酶的方法。本发明提供的胆固醇氧化酶重组菌株可用于对3-羟基类甾体化合物进行3位羟基脱氢或甾醇代谢，还可用于降解甾醇的应用，从而解决了甾体医药工业中分枝杆菌和红球菌降解甾醇利用率低的问题。

 (1)胆固醇氧化酶的热稳定参数熔解温度

 熔解温度通过差示扫描量热仪进行测定。测定时，取制备得到的纯胆固醇氧化酶酶液，蛋白浓度为1.0mg/mL，缓冲液体系为Tris-HCl缓冲液(pH 9.0，20mM)。温度变化速率为10℃/min，温度变化区间为20～90℃。结果显示胆固醇氧化酶的熔解温度Tm值为71.03。

(2)胆固醇氧化酶的有机溶剂耐受性

取胆固醇氧化酶纯酶液2U/mL，与30％(v/v)不同种类(如乙酸乙酯、石油醚、丁醇、氯仿、苯、甲苯、对二甲苯、1,3,5-三甲苯、环己烷、正己烷、正辛烷)的疏水性有机溶剂混合，以添加30％(v/v)水的纯酶液作为对照，置于37℃、转速为200rpm的摇床中震荡培养24小时，使用胆固醇作为底物，测定混合后残留的酶活，结果如表3所示。表明胆固醇氧化酶在有机溶剂中的相对残留酶活高于水溶液中残留酶活，该酶具有良好的有机溶剂耐受性。